PCR 的历史

聚合酶链式反应（PCR）彻底改变了分子生物学领域，使科研人员能够扩增 DNA 序列用于从基因分型到基因表达分析的多种应用。然而，PCR 的成功离不开 DNA 聚合酶的进化，DNA 聚合酶在 PCR 循环中介导 DNA 的合成。本文探讨了现代 PCR 的历史，从首次分离 DNA 聚合酶到新一代聚合酶（如 Thermo Scientific Phusion DNA 聚合酶）的开发历程。

图1.PCR 的演变（1950–2010年）。该信息图说明了聚合酶链式反应（PCR）技术从1950年提出概念到2010年完善的60多年间的历史发展。该图突出了不同科学家对 PCR 发展的重大贡献及其对现代分子生物学的影响。

现代 PCR 的历史始于1976年，从嗜热细菌Thermus aquaticus中分离出 Taq DNA 聚合酶。它的分离意味着分子生物学研究人员现在拥有了一种能够重复 PCR 循环的热稳定酶，无需在每次循环后加入新鲜的 DNA 聚合酶。回想很久之前，在4-5小时内重复设置 PCR 反应多达40次并不是一件有趣的事情，也不能充分利用时间， Taq 酶在很多方面让我们的实验生活变得更好！

Taq DNA 聚合酶迅速获得了成功；1989年，《科学》杂志将 DNA 聚合酶分子选为“年度分子”。1988年，当Kary Mullis 和 Cetus Corporation 将该酶商业化并使其广泛使用时， Taq 酶对分子生物学的影响变得显而易见。随着 PCR 仪和商业 Taq 酶的引入，我们终于可以告别那些在水浴前为扩增 DNA 而劳累的下午。

尽管这些发展代表了重大进展，但 Taq DNA 聚合酶仍有改进的空间。 Taq DNA 聚合酶容易出错，在高温下不稳定，并且难以扩增 GC 含量丰富或具有复杂二级结构的 DNA。这些因素导致 PCR 早期发展缓慢，尤其是在需要高特异性和可靠性的应用中。人们很快发现，DNA 聚合酶的发展与 PCR 技术的改进息息相关。为了提高 PCR 的性能并将 PCR 技术扩展到更广泛的应用范围，需要研发更先进的 DNA 聚合酶。

传统 PCR 中使用的Taq DNA 聚合酶在较低的温度下具有内在活性。该活性可能导致非特异性扩增、假阳性结果和较低的靶标产率。热启动技术在1980年代后期被引入，作为克服 Taq DNA 聚合酶相关性能问题的解决方案。热启动 PCR 方法采用酶修饰物（如抗体、亲和体、适配体或化学修饰物）在室温下抑制 DNA 聚合酶活性。在 PCR 的初始变性步骤之后，热启动敏感的修饰物被释放，聚合酶变得具有活性。 

这种通过热启动技术控制聚合酶的激活具有几个优点。首先，它在 PCR 反应的初始阶段降低了非特异性扩增的可能性，从而能获得更清晰的条带和更高的目标 DNA 产量。热启动机制还提高检测灵敏度并仅扩增靶片段。这在扩增低拷贝数靶标时尤其重要。最后，可以使用热启动 DNA 聚合酶在室温下配制反应体系，并可以在实验台放置数小时而不会影响 PCR 结果。此功能对于同时处理多个样品并采用自动化技术的高通量实验室特别有用。

阅读更多关于热启动技术如何有益于您的 PCR 的信息

热启动聚合酶增强了 PCR 性能，现已广泛用于多种应用，包括基因表达分析、基因分型、克隆和诊断检测。

1991 年，从太平洋海底热液喷口中发现的嗜热古细菌Pyrococcus furiosus中分离并开发出 Pfu 聚合酶，标志着分子生物学研究的重大突破。Pfu DNA 聚合酶具有内在的3’至5’核酸外切酶校对活性，可以纠正核苷酸掺入错误，降低错误率，并提高特异性。Pfu 和 Taq 聚合酶的开发和使用持续了一段时间。PCR 在一些开创性研究中发挥了重要作用，例如1995年 Venter 及其同事对流感嗜血杆菌的测序。然而，尽管这些聚合酶对许多基础应用非常有用，但它们不能提供所需的准确性、可靠性和读取长度，难以推动 PCR 进入令人兴奋的新领域。

2003年推出的 Phusion DNA 聚合酶，是开发新一代聚合酶和高保真 PCR 的第一步。这些特别设计的 DNA 聚合酶可以克服或减少限制 PCR 发展的问题。第一代 Phusion 高保真 DNA 聚合酶源于具有热稳定双链 DNA 结合结构域的Pyrococcus-like酶，具有高校对活性，与模板的亲和力更高，并且在长片段或高 GC 含量模板上具有更好的表现。

多年来，赛默飞世尔科技不断开发 Phusion DNA 聚合酶单酶、预混液和针对不同应用（如定点突变和快速 PCR）进行优化的试剂盒。最近，Thermo Scientific Phusion Plus DNA 聚合酶问世，这是 Phusion DNA 聚合酶的升级版本，具有更高的保真度（>100倍 Taq 聚合酶保真度）、通用引物退火能力以及复杂样板高效扩增能力，使其更加方便易用。

总之，DNA 聚合酶的进化在 PCR 技术的进步中发挥了关键作用。工程设计 DNA 聚合酶的进展使得 PCR 扩增更快速、更可靠和更准确，为遗传学、医学和生物技术开辟了新的可能性。phusion DNA 聚合酶是这一进展的一个主要例子，使其成为分子生物学研究人员的宝贵工具。新一代聚合酶与实时和数字 PCR 技术的结合为科学研究和医疗保健领域的重大进步做出了贡献。随着 DNA 聚合酶和 PCR 方法的进一步发展，我们预计科学研究将取得更大的突破，从而对世界产生积极影响。