Search Thermo Fisher Scientific
一步法与两步法 RT-PCR 之间的差异是什么？
RT-PCR 可以按一步法或两步法进行。一步法检测是在一个反应管和缓冲液中进行反转录和PCR，同时使用反转录酶和 DNA 聚合酶。一步法 RT-PCR 仅使用序列特异性引物。在两步法中，反转录和 PCR 扩增步骤在独立的管中进行，采用不同的优化缓冲液、反应条件和引物策略。
了解：一步法与两步法 RT-PCR
图 1.一步法与两步法 RT-qPCR。
什么是一步法 RT-PCR？
顾名思义， 一步法 RT-PCR 将第一链 cDNA 合成 (RT) 和后续 PCR 合并在一个反应管中。这种反应设置可以帮助简化您的工作流程，减少变化并且最大限度减少可能的污染。一步法 RT-PCR 可以轻松处理大量样品，使其适用于高通量应用。然而，一步法 RT-PCR 使用基因特异性引物进行扩增，将分析限制于每份 RNA 样品的几个基因。由于反应是反转录条件与 PCR 扩增条件之间的折衷，所以一步法 RT-PCR 可能在某些情况下不太灵敏、不太高效。不过，RT-PCR 中使用基因特异性引物可以最大限度地提高目标cDNA的产量，并最大限度地减少背景扩增。
探索： 一步法 RT-PCR 产品
什么是两步法 RT-PCR？
两步法 RT-PCR 包含两个独立反应，首先进行第一链 cDNA 合成 (RT) ，然后在另一个单独的反应管中扩增第一步所得的 cDNA。因此，两步法 RT-PCR 可用于检测单个 RNA 样品中的多个基因。RT 反应和 PCR 反应的分离允许优化每个步骤的反应条件，并且在反转录引物 (Oligo (dT) 引物、随机六聚体或基因特异性引物)和 PCR 设置 (例如 DNA 聚合酶选择和 PCR 组分) 方面具有灵活性。与一步法 RT-PCR 相比，两步法 RT-PCR 的缺点包括工作流程延长、步骤增多、样本处理和操作增加，并可能增加污染和结果变异的机会。
表 1.一步法与两步法 RT-PCR 比较
| 一步法 RT-PCR | 两步法 RT-PCR | |
|---|---|---|
| 设置 | 在支持反转录和 PCR 的条件下的合并反应 | 针对反转录和 PCR 的单独优化反应 |
| 引物 | 基因特异性引物 | 选择 Oligo (dT)、随机六聚体或基因特异性引物 |
| 理想用途 | 分析几个基因；高通量平台 | 多基因分析 |
| 优势 |
|
|
| 缺点 |
|
|
了解更多： 反转录产品
Learn more
Explore
仅供科研使用，不可用于诊断目的。