外泌体常见问题解答（FAQ）

是否已知 CD9 或 CD81 等因子对外泌体来源具有特异性？

目前未就一般外泌体标志物达成共识。研究界目前的建议是将检测多种膜结合蛋白或膜相关蛋白结合起来，以验证膜是否存在。我们自己的经验是，靶点 CD63 和 CD81 以及 CD9 存在于多种不同的外泌体制剂中 。然而，我们检测到至少 2 种释放外泌体的不同细胞系，这些细胞系是 CD9 阴性的 （Jurkat 细胞和几种 B 细胞淋巴瘤细胞， Oksvold 等人， 2014）。同样重要的是，通过对已知在内质网、高尔基体或细胞核等区室中表达的标志物进行染色，证明不存在污染囊泡。使用相同的标志物对宿主细胞进行表征也同样重要。

可以通过使用 FACS 分析与 Dynabeads 产品结合的标记外泌体来定量外泌体数量吗？

可以。Dynabeads 磁珠的设计和生产方式适用于细胞分离、蛋白分离、核酸分离、T 细胞活化和扩增（以及目前也用于外泌体捕获和分离），有助于确保高度可重复性。所有磁珠大小相同，其表面化学成分具有极低的非特异性结合率和较高的信噪比。考虑到这一点，使用 Dynabeads 分离外泌体（注意磁珠浓度和捕获体积）可以实现恒定的结合动力学。该设置不会为您提供磁珠表面外泌体数量的确切结果，但将由于线性方式增加而提供增强的信号。因此，磁珠可用于测量外泌体，例如：监测细胞中的外泌体释放效率。

必须使用电子显微镜来估算外泌体的数量，即用 Dynabeads 分离外泌体，然后完成 TEM 样品制备。使用包被外泌体的 Dynabeads 超薄切片进行立体分析，可以得出每颗珠子的外泌体数量。在此之前，我们曾将立体学计算的外泌体数量与流式细胞术获得的信号进行了比较。TEM 检测到的计数增加与流式检测和免疫印迹检测到的信号增加相关。

如果样品是血清，如何区分不同来源的外泌体？

关于外泌体的特征描述和比较，可按照我们在出版物（Oksvold 等人， Clinical Therapeutics 2014 年 6 月 36 ， 847-862.e1 ， PMID:24952935）中的方法进行。我们从比较典型外泌体标记（如四次跨膜蛋白和 B 细胞特异性标志物）的表达入手，对 4 种不同的 B 细胞淋巴瘤来源的外泌体进行了表征。然后，在预富集外泌体后，用针对 CD81+ 和 CD63+ 外泌体的 Dynabeads 磁珠分离外泌体，再进行表征。有趣的是，外泌体标志物和 B 细胞标志物的表达在所有 4 种 B 细胞淋巴瘤来源外泌体之间均有所不同。血清作为起始样本的复杂性质将增加复杂性。建议在此处进行预清除步骤（例如在 Dynabeads 分离前使用尺寸排除色谱仪）。

使用 Dynabeads 磁珠进行 FACS 分析时，哪种捕获抗体（CD9、CD63、CD81......）最适合检测血浆中预先富集的外泌体？

目前，我们没有使用 Dynabeads 从血浆中分离外泌体的优化实验方案。但是，在进行尺寸排除色谱分析后，我们已经可以使用 "Dynabeads CD9 " [即外泌体人 CD9 分离试剂（来自细胞培养物），从血浆中捕获 CD9 阳性外泌体，货号 106-14D]。我们推荐使用这些磁珠进行检测，这些磁珠在所有 CD9 阳性外泌体样品的检测中效果很好。

使用超速离心法从预富集的外泌体中纯化外泌体时，建议使用多大的体积，产量（如蛋白质总量）有多高？这与使用 Dynabeads 磁珠的直接方法相比如何？

我们在网络研讨会中展示的是使用 Dynabeads 分离预富集的外泌体与使用 Dynabeads 的直接捕获策略之间的对比。为进行对比，保持结合动力学恒定并调整外泌体浓度因子至关重要。在我们的实验中，通过超速离心预富集外泌体的浓度系数为 x42 ，通过沉淀预富集外泌体的浓度系数为 x16。我们在全部分离中加入等量的外泌体，将分离磁珠的量保持在 20 μL ，分离体积保持在 100 μL。理论上，我们预计在所有三次分离中可以捕获相同数量的外泌体。然而，当通过超速离心预富集时，我们似乎会丢失囊泡，这并不奇怪。在我看来，超速离心是捕获所有囊泡的终极方法，这种观点有点奇怪，因为它需要非常熟练的技术人员才能避免囊泡在制备过程中丢失。当样品中有足够外泌体时，直接捕获是更好的选择。我建议，只有当起始样本中外泌体含量较少或体积较大时，才使用 Dynabeads 进行预富集，然后再进行捕获。

产品 外泌体 - 人 CD81 分离 （来自细胞培养物）或 外泌体 - 人 CD81 流式检测试剂 （来自细胞培养物）中使用的磁珠浓度是多少？

我们使用什么浓度的 Dynabeads 磁珠取决于下游应用。通常，对于流式细胞术，我们希望每个磁珠有尽可能多的外泌体提供较强的信号。因此，使用的磁珠很少。对于下游蛋白质免疫印迹，使用多个磁珠可使较大数量的外泌体扩展至较大的表面积。

• 对于流式细胞仪，每 100 μL 分离体积使用 20 μL 1x10⁷ Dynabeads
• 对于蛋白质免疫印迹，每 100 μL 分离体积使用 20 μL 1.3x10⁸ Dynabeads
  

我从多少蛋白开始？

我不建议过多关注蛋白质浓度，将其作为对制备物中外泌体数量的估计。我们的经验是，这种相关性并不总是很好。我们大多数情况下都使用细胞培养物和尿液作为起始样品，即使使用如此" 简单 " 的溶液（至少与血浆/血清相比），这种相关性也没有那么好。这就是为什么我们开始关注细胞培养物生长条件并实现外泌体收获条件标准化的原因，以便在正确的时间实现收获并提高系统的可重复性。这也正是我们使用 Dynabeads 磁珠来收集细胞生长过程中的外泌体的原因，以此作为估算外泌体量的更好方法。 我认为血浆和血清中的蛋白浓度与外泌体含量之间的相关性甚至更低。

我应该使用多少个 Dynabeads 磁珠进行外泌体分离？

用于捕获外泌体的磁珠量取决于下游应用。对于流式细胞仪，您需要使用尽可能少的珠子来获得强信号，即最大限度地增加每个珠子的外泌体负荷，并在每个珠子通过流式细胞时提供信号。这与蛋白质印迹等需要更多总外泌体来获得信号的方法明显不同。这可以通过在分离过程中显著增加磁珠的量来实现，以提供更大的总表面积。

• # 流式细胞术使用的磁珠：含有外泌体的 100 μL 体积中 20 μL 磁珠（1x10⁷ 磁珠/mL 的储备液）
• # 蛋白质免疫印迹使用的磁珠：含有外泌体的 100 μL 体积中 20 μL 磁珠（1.3x10⁸ 磁珠/mL 的储备液）
• # 蛋白质组学使用的磁珠：如果这涉及质谱分析应用，我们目前还没有为此优化实验方案。但是，我认为这些条件应该更加类似于蛋白质免疫印迹的条件，而不是流式细胞术，以便捕获更多的外泌体进行分析。

如何从 Dynabeads 磁珠中释放外泌体？

目前我们还未优化出磁珠上外泌体的释放方法。低 pH 或高盐技术已经被用于从磁珠中释放蛋白质复合体，我知道一些研究人员也会使用这些技术来释放外泌体。然而，我没有看到过此类处理后外泌体功能的任何数据。如果下游应用是质谱分析，可以在存在磁珠的情况下处理外泌体用于MS。

哪些标志物可用于外泌体表征？

据我所知（即使与细胞外囊泡领域的许多关键意见领袖协商后），目前，对于在所有外泌体上都能找到一种通用的外泌体标志物，还未达成共识。研究界目前的建议是将检测多种膜结合蛋白或膜相关蛋白结合起来，以验证膜是否存在。根据我们自己的经验， CD63 和 CD81 以及 CD9 等靶点存在于多种不同的外泌体制剂中 。然而，我们可以检测到至少 2 种释放外泌体的不同细胞系，这些细胞系是 CD9 阴性的 （Jurkat 细胞和几种 B 细胞淋巴瘤细胞）。在内部，我们通常会使用以下检测抗体标记 CD9、CD81 和 CD63，以验证我们的制剂中是否存在膜：

• 外泌体——抗人 CD9（用于 Western）（货号 10626D）
• 外泌体——抗人 CD81（用于 Western）（货号 10628D）
• 外泌体——抗人 CD63（用于 Western）（货号 10630D）

这些检测抗体已经过验证，可与预富集的外泌体以及经 Dynabeads 磁珠分离的外泌体配合使用。Tsg101 和膜联蛋白也作为有用靶点被提及。
就不同标志物而言，表征宿主细胞以确定来自这些细胞器的污染性囊泡水平也很重要：

• 内质网：HSP90B1 ，钙连蛋白
• 高尔基体：GM130
• 线粒体：细胞色素 C
• 细胞核：组蛋白

如何储存外泌体？

我们将外泌体储存在含 0.1% BSA 的 PBS 中，因为这是用于在沉淀后溶解沉淀的缓冲液。与新鲜制备的外泌体相比，在 -80°C 下冷冻后外泌体的分离效率没有变化。为了直接从细胞培养基或甚至尿液中分离，我们已经冷冻了细胞培养物，未添加任何形式的冷冻保护剂，如甘油。

您是否有从小鼠细胞中分离外泌体的 Dynabeads 产品？

我们目前提供的 Dynabeads 磁珠靶向表达 CD9 的人外泌体（货号 106-14D）， CD63（货号 106-06D）， CD81（货号 106-16D）或 EpCAM（货号 106-18D）。用于靶向其他标志物，包括其他物种， Dynabeads 链霉亲和素（货号 106-08D）可与所选的生物素标记一抗结合使用。

如何量化外泌体的数量？

纳米颗粒跟踪分析（NTA）可能是最常用的方法，用于获取溶液中颗粒平均大小和浓度的信息。然而，这种方法无法区分囊泡和相同大小的蛋白聚集体。因此，我们建议将该方法与显微镜技术结合，以验证是否存在膜。我们非常重视细胞培养和外泌体收获条件，以便每次收获都能产生等量的外泌体；在我们看来，这比估算制备物的蛋白质浓度重要得多。

Dynabeads 磁珠的设计和生产方式适用于细胞分离、蛋白分离、核酸分离、T 细胞活化和扩增（以及目前也用于外泌体捕获和分离），有助于确保高度可重复性。所有磁珠大小相同，其表面化学成分具有极低的非特异性结合率和较高的信噪比。考虑到这一点，使用 Dynabeads 分离外泌体（注意磁珠浓度和捕获体积）可以实现恒定的结合动力学。该设置不会为您提供磁珠表面外泌体数量的确切结果，但将由于线性方式增加而提供增强的信号。因此，磁珠可用于测量外泌体，例如：监测细胞中的外泌体释放效率。

必须使用电子显微镜来估算外泌体的数量，即用 Dynabeads 分离外泌体，然后完成 TEM 样品制备。使用包被外泌体的 Dynabeads 超薄切片进行立体分析，可以得出每颗珠子的外泌体数量。在此之前，我们曾将立体学计算的外泌体数量与流式细胞术获得的信号进行了比较。通过 TEM 增加的计数与流式和免疫印迹信号增加相关。

如何从细胞培养基中去除外泌体？

可以考虑使用 Dynabeads 产品作为去除磁珠。例如，使用混合物中的 Dynabeads CD9（货号 10614D），CD81  （货号 10616D）或 CD63（货号 10606D）试剂，甚至按顺序从溶液中去除外泌体。

可以从病毒颗粒中回收外泌体吗？如果能，如何操作？

可以通过两种方式分离外泌体与病毒颗粒：阴性分离或者阳性分离。如果抗体靶向病毒抗原，这些抗体可偶联至 Dynabeads 磁珠，非共价结合至配体磁珠，如 Dynabeads Protein G（货号号 10003D）或共价结合至表面活化磁珠，如 Dynabeads M-270 环氧树脂（货号 14302D）或 Dynabeads 抗体偶联试剂盒（货号 14311D）。通过这种方式，可以去除病毒颗粒样品并保留未结合的外泌体。或者，可以使用准备好的 Dynabeads CD9（货号 10614D）， CD81（货号 10616D）或 CD63（货号 10606D）从溶液中拉出外泌体。

该分离试剂盒可用于下游的质谱分析实验吗？

使用 Dynabeads 磁珠的直接分离可通过质谱法进行下游分析。

用于蛋白免疫印迹的蛋白浓度是多少？

我们的经验（以及其他人）是：蛋白质测量与制剂中外泌体数量之间无相关性。据我所知，在使用哪种方法上没有真正的共识。许多研究人员使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定囊泡数量和大小分布，但该方法无法提供相同大小范围内任何污染性囊泡的信息。因此，电子显微镜应该始终与这种方法结合使用。检查是否存在污染性囊泡的一种方法可能是采用蛋白质免疫印迹检测蛋白，如 gp96 ， ER 相关蛋白。

我们专注于标准化细胞培养和外泌体收获条件，以提高每种外泌体制剂加载等量外泌体的可能性。此外，还可使用不同蛋白起始量设置标准曲线，进行蛋白质免疫印迹并将靶标信号与印迹上这些条带关联。此外，正如我们在网络研讨会中介绍的那样，我们还注意外泌体起始量（以及我们使用预富集材料开始的浓度因子）、分离体积以及捕获磁珠的量，以保持结合动力学和外泌体起始量恒定，从而能够对比不同样品之间的结果。

我已使用 总外泌体分离试剂盒 （货号4484450）将制备的外泌体在 -80°C 下长期储存。使用 外泌体 RNA & 蛋白分离试剂盒 （货号4478545）可以提取 RNA 和蛋白吗？

可以。我们通常使用新鲜培养基或在 4°C 下储存最长一周的培养基，但在 -20°C 或 -80°C 下冷冻的外泌体也可以使用。理想情况下，外泌体应仅冷冻/解冻 2 至 3 次；多次冷冻/解冻循环会部分损坏外泌体/EV。

赛默飞世尔科技是否提供一个可以在体外制备外泌体用于掺入 RNA 或蛋白质的转染系统？

赛默飞世尔科技提供一系列转染试剂，包括广泛使用的 Lipofectamine 2000 和 RNAi MAX 转染试剂。从递送的角度来看，外泌体绝对有前景。然而，使用复杂的生物囊泡进行递送面临许多挑战和限制。

哪种类型的全基因组扩增（WGA）试剂盒可用于提高肿瘤来源外泌体的 DNA 浓度？

外泌体 DNA 尚未得到充分研究。获取非常干净的外泌体制剂并通过所有可用的方法对其进行初步表征至关重要。至少使用 NanoSight 纳米颗粒跟踪分析（NTA）确保您的实验方案不会与外泌体一起回收大微囊泡，以避免长 DNA 被严重污染。我建议使用大样品体积来回收足量外泌体及其 DNA/RNA 载体。总的来说，这是一个非常有趣的探索领域。我推荐使用大样品体积来回收足量外泌体及其 DNA/RNA 载体。测序前，使用至少 4 mL 的血清/血浆进行处理以回收足量核酸来运行 Bioanalyzer、NanoDrop 仪器和其他典型的分析方法。

如果大多数 miRNA 与蛋白质连接且外泌体中仅 20% ，那么现在所描述的方法是否足以区分两种 microRNA 来源？

miRNA 的大部分与蛋白相关。Ago2 和其他蛋白质 miRNA 复合物可以通过与 Dynabeads 磁珠偶联的抗体进行分离。之后，可以用总外泌体分离试剂（货号 4478359）从同一样品中沉淀外泌体，或者可以用 Dynabeads CD9、CD63 或 CD81 产品分离外泌体群。我们没有发现任何论文讨论过从同一体液源（蛋白质-miRNA、外泌体、微囊泡等）中分别回收不同的实体。

是否对比了直接捕获和预富集实验方案之间的外泌体 RNA 收率？

使用 Dynabeads 磁珠，典型的初始步骤是用总外泌体分离试剂（货号 4478359）进行预富集（例如，您可以从细胞培养基中回收总外泌体群，然后分离出含 Dynabeads 的 CD9、CD63 或 CD81 阳性外泌体）。如现在所示，也可以使用 Dynabeads 产品直接捕获外泌体。

就直接分离后的 RNA 含量分析而言，所进行的实验较少。我们主要分析了使用如总外泌体分离（细胞培养基）（货号 4478359）试剂分离的前体外泌体 RNA 载体。因 Dynabeads 捕获潜在外泌体亚型， RNA 收率较低。

根据文献，外泌体似乎没有 18S mRNA。你能对此进行评论吗？

我们已经通过测序和 qPCR 分析了外泌体 RNA 含量，这些囊泡明确包括一些 18S RNA。我们认为早期的文献是误导性的。一个团队声称外泌体载体为 miRNA 和 mRNA 阴性，其他所有人都将此观点奉为信条。事实上，外泌体包含核糖体 RNA、tRNA、许多非编码RNA，而且很大一部分 miRNA 实际上与蛋白质（如Ago 2）而非外泌体有关。

您能否描述外泌体 RNA 分离的工作流程以及您如何进行 PCR ？

有关外泌体分离和 PCR 的详细信息参见以下文章：

• Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes.E. Zeringer, M. Li, T. Barta, J. Schageman, K. W. Pedersen, A. Neurauter, S. Magdaleno, R. Setterquist, A. V. Vlassov.World J Methodol 2013 March 26; 3(1): 11-18.
• Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers.M. Li, E. Zeringer, T. Barta, J. Schageman, A. Cheng and A. V. Vlassov Phil.Trans.R. Soc.B 2014 369, 20130502, August 2014.
• The Complete Exosome Workflow Solution: From Isolation to Characterization of RNA Cargo.J. Schageman, E. Zeringer, M. Li, T. Barta, K. Lea, J. Gu, S. Magdaleno, R. Setterquist, and A. V. Vlassov.Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International (2013).
  

如演示中所述，哪些出版物描述了从不同液体中回收外泌体的数量，进行 RT qPCR ，然后进行下一代测序？

• Exosomes: Current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.A. V. Vlassov, S. Magdaleno, R. Setterquist, R. Conrad Biochimica et Biophysica Acta 1820 (2012) 940–948.
• The Complete Exosome Workflow Solution: From Isolation to Characterization of RNA Cargo.J. Schageman, E. Zeringer, M. Li, T. Barta, K. Lea, J. Gu, S. Magdaleno, R. Setterquist, and A. V. Vlassov.Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International (2013).
• Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes.E. Zeringer, M. Li, T. Barta, J. Schageman, K. W. Pedersen, A. Neurauter, S. Magdaleno, R. Setterquist, A. V. Vlassov.World J Methodol 2013 March 26; 3(1): 11-18.
• Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers.M. Li, E. Zeringer, T. Barta, J. Schageman, A. Cheng and A. V. Vlassov Phil.Trans.R. Soc.B 2014 369, 20130502, August 2014.
• An optimized procedure for exosome isolation and analysis using serum samples: Application to cancer biomarker discovery.M. Li, A. J. Rai, G. J. DeCastro, E. Zeringer, T. Barta, S. Magdaleno, R. Setterquist, A. V. Vlassov.Methods (2015) .

应包括哪些对照品，以确保仅从外泌体中分离 miRNA 的最大信噪比？

我尚未看到关于单独回收同一体液来源（蛋白质 miRNA、外泌体、微囊泡等）的不同实体主题的文献。然而，已知许多团队正在研究全血清或血浆 RNA 的组分与分析。

使用磁珠时外泌体的回收率是多少？您使用的细胞样品的工作体积是多少？

我们使用的 Dynabeads 磁珠浓度取决于下游应用。通常，对于流式细胞术，我们希望每个磁珠有尽可能多的外泌体提供较强的信号。因此，使用的磁珠很少。对于下游蛋白质免疫印迹，使用多个磁珠可使较大数量的外泌体扩展至较大的表面积。

• 对于流式细胞仪，每 100 μL 分离体积使用 20 μL 1x10⁷ Dynabeads
• 对于蛋白质免疫印迹，每 100 μL 分离体积使用 20 μL 1.3x10⁸ Dynabeads

下图显示了磁珠量对流式细胞 （图 A） 和蛋白质免疫印迹 （图 B）中信噪比（S/N）的影响。这里的 "1x " 磁珠代表我们用于流式细胞的量，而 "25x " 代表用于蛋白质免疫印迹的量。

• A 流式细胞术中的磁珠量和信号

• B 免疫印迹中的磁珠量和信号

您能详细描述您使用的蛋白质免疫印迹实验方案吗？

我们使用的产品包括：

• 外泌体——人 CD9 分离（货号 10614D）
• 外泌体——人 CD81 分离（货号 10616D）
• 外泌体——人 EpCAM 分离（货号 10618D）
• 高达 2 mL 样品体积磁力架：DynaMag-2（货号 12321D）
• SeeBlue Plus 2 对照品（货号 LC5925）
• 4x LDS Bolt 样品缓冲液（货号 B0008）
• Bolt Bis-Tris 蛋白 Plus 凝胶 10 孔（NW04120BOX）
• Bolt MES SDS 电泳缓冲液（20x）（货号 B0002）
• Bolt 转印缓冲液（货号 BT0006）
• Bolt Wet 转印系统
• 用于电泳和 wet 转印的 Bolt 小型槽
• 外泌体——抗人 CD9（用于 Western）（货号 10626D）
• 外泌体——抗人 CD81（用于 Western）（货号 10630D）
• 外泌体——抗人 CD63（用于 Western）（货号 10628D）
• SuperSignal West Dura 持久性底物（货号 34076）

分离过程中外泌体含量会变化吗？

这是一个非常有趣的问题。我知道 Hendrix 等人对比了超速离心（UC）法和沉淀法，声称梯度 UC 更好。此外， Tauro 等人（2012）进行了对比，认为使用磁珠进行的免疫捕获是最佳方法。我想这些结果反映了目前尚未达成共识的事实。我认为，制备所涉及的步骤越少，结果越好。很显然，使用 UC 作为预富集步骤将导致囊泡丢失，即便您是真正熟练的操作人员也是如此。因此，即使囊泡的纯度较高，也无法控制处理过程中丢失的囊泡。

有没有人成功使用总外泌体分离试剂离心后产生的外泌体颗粒进行可视化？我们希望在不同的细胞处理后对培养基中的外泌体进行定量。我发现很难确信在去除培养基/重悬颗粒的过程中，没有丢失任何外泌体材料。

我们从内部经验中知道的是，在制备过程中存在材料丢失的风险——正如我们在网络研讨会上所展示的，在超速离心（UC）过程中，材料似乎会丢失。当然，材料丢失量也取决于操作人员的经验。当采用预富集外泌体的方式进行沉淀时，材料的丢失似乎较少。与超速离心方案相比，该方案简单得多。但是，通过省略工作流程中的这一步骤并使用 Dynabeads 磁珠捕获外泌体，该方法可用于测量细胞培养过程中外泌体的释放，以便在最佳时间点收获。当然，如果缺乏用于分离的标志物，这种方法可能会丢失一些外泌体。但是，去除数据表明，使用足量磁珠进行分离可以实现高度去除。综上所述，我确信目前没有方法可以确保制剂中所有外泌体完全分离。因此，目前的最佳表征方式是结合多种方法。

若要进行更好的低温储存使用甘油（在这种情况下，浓度是多少？）是否更好，或者在分离外泌体的培养基中冷冻外泌体是否足够？

对于储存外泌体，我们采用含 0.1% BSA 的 PBS ，因为这是用于在沉淀后溶解沉淀的缓冲液。与新鲜制备的外泌体相比，在 -80°C 下储存后外泌体的分离效率无变化。为了直接从细胞培养基或甚至尿液中分离，我们已经采用这种方式冷冻制剂，未添加任何形式的冷冻保护剂，如甘油。我们还未检测甘油的使用，所以不知道这将如何影响分离效率。

总外泌体 RNA 和蛋白质分离试剂盒的工作原理是什么？

总外泌体 RNA 和蛋白分离试剂盒 专为外泌体样品开发，并采用初始酸 - 苯酚：氯仿萃取。随后将乙醇添加至水相，然后样品通过含滤芯的玻璃纤维， 将 RNA 固定。洗涤滤芯并以低离子强度溶液洗脱 RNA。该试剂盒可回收所有长度超过 10 nt 至数 kb 的 RNA。（大多数外泌体 RNA 的大小范围为 ~20 – 300 nt。）本产品手册还描述了富集短 RNA（<200 nt）的附加实验方案，但我们建议使用总 RNA 分离实验方案，以尽可能提高所有 RNA 的回收率，包括各种 mRNA、rRNA 和 ncRNA 片段。

该试剂盒还提供了使用外泌体重悬溶液从同一样品中回收蛋白的选项。该试剂盒可用于使用总外泌体分离试剂或任何其他方案（如超速离心）从任何样品类型纯化的外泌体中分离 RNA 和蛋白质。

添加乙醇后，溶液变浑浊。这是否会影响 RNA 回收率？

不会，上述结果对 RNA 回收率没有负面影响。

可以从外泌体中回收多少 RNA ？

这可能因样品类型、样品体积、分离方法和外泌体含量/浓度而异。 下面列出了一些示例：

• 使用 总外泌体分离（来自细胞培养基） 试剂从30 mL HeLa 细胞培养基中分离外泌体时，可以回收 ~8 ng 外泌体 RNA。
• 使用 总外泌体分离（来自血清） 试剂从 4 mL 血清中回收外泌体 RNA ，可获得 ~2 ng 外泌体 RNA。

在这两种情况下，这些量的 RNA 足以进行 Ion Torrent PGM 或 Proton 测序的 RNA 文库构建。实时荧光定量 PCR 分析总体需要更少量的 RNA ，可使用更小的样品体积。例如：从 3 μL 血清或 30 μL 细胞培养基中回收的 RNA 足以进行一次 RT-qPCR 反应。

目前的外泌体分离方法是什么？

传统的细胞培养基和体液中外泌体分离是一个繁琐且困难的过程，通常基于结合蔗糖密度梯度或蔗糖垫的超速离心技术，使相对低密度的外泌体远离其他囊泡和微粒。这些方案可能需要长达 30 小时，需要进行超速离心和全面培训。尽管有这些缺点，但这仍然是最典型的外泌体分离方法。

然而，在最近几年里，从细胞培养基和各种体液中分离外泌体的多种试剂已经由赛默飞世尔科技和其他公司上市销售。赛默飞世尔科技提供的总外泌体分离试剂采用耗时非常短且可靠的方案来回收外泌体。这种方法越来越受欢迎。

赛默飞世尔科技提供哪些外泌体研究产品？

如下所述，可提供专为外泌体研究开发的多种产品： www.thermofisher.com/exosomes。我们正在不断扩展此系列产品。

此外，我们提供许多用于分析外泌体载体的试剂、试剂盒和仪器，包括：带 TaqMan 检测的 RT-qPCR ，Ion Torrent PGM 二代测序，RNA Proton 和 Ion Torrent NGS 仪器以及用于蛋白质研究的蛋白质免疫印迹仪器和试剂。

总外泌体分离试剂的工作原理是什么？与其他外泌体分离技术有何不同？

在分离外泌体试剂的开发过程中，我们评估了多种不同的技术（例如超速离心，超滤，凝胶过滤柱， HPLC 和过滤器）。我们还评估了更先进的方法（例如：使用各种聚合物的沉淀法，以及使用抗体和各种凝集素的磁珠与色谱柱结合法）。此外，我们还评估了不同公司的市售产品。

我们基于其卓越的性能选择了其中一种聚合物，该聚合物成为总外泌体分离试剂的关键成分（已提交专利备案）。该试剂可束缚水分子，从而迫使难溶组分（如囊泡）从溶液中析出，随后即可通过短时间的低速离心来收集这些难溶组分。然后，回收的外泌体可用于生物学研究或终点分析。所有总外泌体分离试剂具有相同的核心化合物，但都经过仔细优化（包括方案中的调整），以能够从特定样品类型中高效分离外泌体。

总外泌体分离试剂可以从其他物种中分离外泌体吗？

可以，这些试剂也可用于小鼠样本。这些试剂可能还可以从任何物种的样品中分离外泌体，但到目前为止只在人和小鼠中进行过检测。

总外泌体分离（从血清）试剂是否可以处理血浆样品？

由于血浆含高水平的凝血因子，因此与血清相比，血浆是一种更具挑战性的样品类型。目前的血清试剂可用于血浆，但制剂中可能含有更多污染蛋白和微囊泡。针对血浆，我们建议使用 总外泌体分离（来自血浆） 试剂，并采用专为处理血浆而优化的实验方案。

使用总外泌体分离试剂回收的外泌体的纯度是多少，是否与超速离心相似？

获得的样本包含所有外泌体、少量的额外微囊泡和已共沉淀（在血清和其他体液的情况下）的大蛋白分子/复合物。该纯度级别适用于大多数应用，并通过方法优势进行平衡。优势包括：1）快速简单的工作流程， 2）无需特殊设备（例如超速离心机）， 3）外泌体完全回收， 4）适用于小样品体积的灵活性（例如 100 μL），4）能够在一次实验中处理多个样品。

为实现采用总外泌体分离（来自细胞培养基）试剂进行初始纯化后回收非常干净的外泌体群，我们还提供与抗 CD63 抗体偶联的 Dynabeads。这一额外步骤将增加工作流程时间且外泌体的最终收率将更低——但对于需要从细胞培养基中获得超洁净 CD63 阳性外泌体的项目，这是最佳的选择。链霉亲和素偶联的 Dynabeads 也可与您选择的生物素标记抗体配合使用，这种抗体对特定外泌体亚群具有特异性。

这些产品不仅可用于分离高纯度的外泌体亚群，还可以用流式细胞仪检测外泌体，这一点由于外泌体体积小，非常难实现。我们认为这些产品是目前外泌体分离的最佳选择。

总外泌体分离试剂与 System Biosciences 的 ExoQuick 试剂对比如何？

总外泌体分离试剂具有独特的配方（已提交专利备案）。使用精心优化的试剂可从主要体液和细胞培养基中回收外泌体。与 ExoQuick 试剂相比，我们提供的产品回收的外泌体的收率和纯度与此类似，有时甚至更高。此外，  我们的试剂可以从更多样本类型中分离总外泌体群，这些产品是从分离到表征到体内研究的大型完整工作流程解决方案的一部分。

分离外泌体可以使用的起始样品最小体积是多少？

每种试剂的最低检测体积参见产品手册。 大多数体液的最低检测体积为 100–200 μL，尿液（800 μL）和细胞培养基（1 mL）略大。 可以使用较小体积的外泌体（尤其是血清和血浆），但我们发现此处列出的最小体积可为多个下游应用提供可用数量的外泌体。 

可以从超过 1 mL CSF 中分离外泌体吗？

可以。使用 总外泌体分离（来自其他体液） 手册中所列程序，我们已成功从多达 5 mL CSF 中回收外泌体。

如果采用总外泌体分离试剂从较大的样品体积 >（5 mL）中回收外泌体，是否需要离心更长时间？

针对比手册中推荐的更大样品体积，建议延长离心时间以确保外泌体的最大回收率。精确离心时间将取决于多种因素，包括：转子，外泌体的沉降系数，试管大小，样品体积和类型以及离心速度。例如，对于 5-10 mL 样品体积，在 10000 x g 速度下离心 1 小时足以沉淀外泌体。但是，如果样品体积更大或者离心机速度无法达到 10000 x g，应使用更长的离心时间。

从细胞培养基和血清中可以分离出多少外泌体？

不同细胞系的数量会有所不同，具体取决于您添加去除外泌体的 FBS 还是非 FBS 或合成培养基。我们来看一个例子：在 30 mL 细胞培养基中生长至每 T175 瓶 ~ 2 x 10⁷ 个 HeLa 细胞，含有去除外泌体的 FBS。使用 总外泌体分离（来自细胞培养基） 试剂可以从 1 mL 的该细胞培养基中回收 ~4-8 x 10⁹ 外泌体，该值用 NanoSight LM10 测量。使用 总外泌体分离（来自血清） 试剂可以 从 100 μL 血清中回收 ~1.5-3 x 10¹¹ 外泌体。

血浆样品有两种方案选项，我应该选择哪一种？

与血清不同，血浆包含许多凝血因子和一些额外的蛋白质，这些物质导致样品难以处理。 为了解决这种困难，我们提供了两种方案选项：一种方案经过蛋白酶 K 处理，另一种方案不经过。 当最终目标是分析外泌体 RNA 或蛋白质载体时，包括蛋白酶 K 处理的方案非常有用。该方案也可以用于分离外泌体以用于其他下游应用，但对 RNA 和蛋白分析最有用。 未经蛋白酶 K 处理的方案也可以分离出良好质量的外泌体，但纯度不如蛋白酶 K 处理的方案高。 未经蛋白酶 K 处理的实验方案在分离用于表面蛋白分析或电子显微镜鉴别的外泌体时更加有用。

由于时间限制，我无法在一天内完成方案。可以过夜沉淀外泌体吗？

可以。总外泌体分离试剂 能够以高收率和纯度轻松回收外泌体。我们强烈建议遵循相应样品类型的实验方案——细胞培养基和各种体液。如果您使用总试剂对样品进行孵育的时间超过推荐的时间 ，最可能的结果是您的收率高，但纯度可能会受到影响，这是因为一些不需要的组分（如某些蛋白）可能也会逐渐沉淀。

分离完成后，外泌体制剂中是否残留任何试剂？如果是，这是否会干扰下游生物研究？

试剂不与外泌体表面结合，分离完成后仅痕量试剂会留在外泌体沉淀物中。这不干扰下游生物研究。 但在将外泌体沉淀重悬于 PBS 或其他所选缓冲液中之前，将上清液完全去除很重要。如果您仍然担心痕量试剂的问题，可以通过透析或使用 外泌体离心柱 （MW 3000）来去除。

分离后并非总能观察到外泌体沉淀，是否正常？仅为确保不会丢失任何外泌体沉淀，可以将一些上清液留在管中吗？

血清和血浆含有大量外泌体，因此即使您从低至 100 μL 的样品中分离外泌体，沉淀也可见。其他体液如尿液或细胞培养基中外泌体浓度明显较低，沉淀在离心后通常不可见。由于沉淀在试管中紧密粘附，因此可以在 PBS 中重悬之前完全去除上清液。如果需要，可轻松标记试管，以便您知道离心后沉淀将粘附在哪里。完全去除上清液至关重要。若未完全除去上清液，将有大量试剂残留，当您重悬外泌体时，一些残留试剂可能仍以聚集体的形式出现在试管底部。

如何定义外泌体？

目前对外泌体的定义很复杂，在该领域尚无绝对共识。通常，外泌体被定义为在基于超速离心的分离过程中在密度为 ~1.13 至 1.19 g/mL 的蔗糖溶液中漂浮的囊泡，预期大小为 30-150 nm（基于电子显微镜分析）。外泌体也可以通过表面蛋白标志物来定义和鉴别，包括以下标志物： 四次跨膜蛋白（CD63 ， CD81 ， CD9）和其他标志物如 ALIX。  目前，在该领域没有适当的工具或足够的知识来设定清晰、简单的外泌体定义，从而将外泌体与其他微/纳米囊泡区分开来。

外泌体由什么组成？

外泌体是脂质双层膜内含有蛋白质和/或 RNA 载体的小囊泡（30-150 nm）。外泌体的载体和表面蛋白质存在很大差异，不同的细胞类型可以分泌不同的外泌体，一些细胞可以分泌多种类型的外泌体。

外泌体形成的机制是什么？

通常将外泌体描述为通过多囊体与质膜融合而起源于内吞途径的囊泡。这些囊泡是细胞分泌的囊泡大家族的一部分，包括微囊泡、外泌体和排出颗粒，这些颗粒源自质膜直接出芽。由于这些实体的大小、密度和总体构成相似性存在重叠，因此使用目前的技术和仪器来分离这些实体非常困难。

如何知道我分离的是外泌体，而不是其他类型的囊泡？

囊泡被归类为外泌体，除大小为 30–150 nm 外，囊泡还应对某些表面蛋白标志物如四次跨膜蛋白呈阳性。最广泛接受的标志物为 CD63 ，但 CD81、 CD9 也被用作标志物。针对目标样品对这些靶标进行蛋白质免疫印迹法是一种相对简单的方法，能够确认囊泡确实是外泌体。然而，由于在该领域尚无绝对共识，目前外泌体的定义并未完全确立。可能需要再花几年时间才能建立所有纳米/微囊泡（包括外泌体）的准确规格并命名。

外泌体如何可视化和/或计数？

由于常规显微镜仅限于至少几微米大小的物体，因此外泌体太小（30-150 nm）无法使用常规显微镜进行观察。可通过光学显微镜观察到小至细菌的结构，甚至是非常大的病毒（如牛痘病毒， 大小约为 0.5µm）。然而，光学显微镜的分辨率太低，无法观察外泌体。

外泌体大小分布分析的典型方法包括 NanoSight 仪器和电子显微镜。虽然方法很不一样，但这两种技术都可以研究大小低至 10 纳米的纳米颗粒。

要确定样品中外泌体的浓度，您可以使用 NanoSight 仪器或 Izon 仪器。NanoSight 仪器能够使用光散射和褐色运动对纳米颗粒（10–1000 nm）进行计数和大小确定，而 Izon 仪器可以使用纳米孔分析实现相同的结果。

储存外泌体的最佳方法是什么？

短期储存时，外泌体可在 4°C 条件下储存最长1周。 外泌体可以在 -20°C 或 -80°C 下长期储存。  长期储存外泌体时，必须考虑它们是否需要解冻一次以上。 如果多种应用需要进行分析（从而需要多次解冻），我们建议将外泌体悬浮液分装到多个管中，以便每个管仅进行一次冷冻/解冻循环。我们发现多次冷冻/解冻循环可损坏外泌体并减少其数量。

当 Westerns 似乎无法工作时，我该怎么办？

这种情况有以下几个典型原因：

1. 添加的样品体积不足。外泌体可能含有少量蛋白质载体。针对初始实验，我们建议尽可能添加更多的样品
2. 抗体并非最佳。我们建议测试 2-3 家生产商的抗体（例如抗 CD63 或其他外泌体标志物），仔细检查推荐浓度。此外，最好使用新鲜抗体，并且需要正确储存。
3. 根据外泌体表面标志物，某些凝胶条件可能更适合靶标抗体（例如还原/非还原和变性/非变性）。我们建议向生产商和外泌体团体咨询您正在靶向的特异性标志物以及使用的特异性抗体的推荐条件。
4. 一般 Western 技术。Westerns 可能很棘手，我们建议在初始测试中使用阳性对照，以确保整个工作流程正常运行。任何蛋白质或抗体只要满足您所需的条件（例如：变性与非变性），均可使用。此外，在提取蛋白时，尝试从样品中浓度极高或极低的蛋白中清除，以防止印迹过载或总信号缺失。