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蛋白质印迹法封闭缓冲液
在使用抗体检测点样或转印到膜上的蛋白质之前，必须封闭剩余的结合表面，以防止抗体发生非特异性结合。否则，抗体或其他检测试剂将结合到最初用于固定目标蛋白质的任何剩余位点上。原则上，任何与检测中的目标蛋白或探针成分（抗体）没有结合亲和力的蛋白都可以用于封闭。然而，在实际应用中，某些蛋白的性能优于其他蛋白，因为它们与膜或其他固定表面结合得更加稳定，或者因为它们能够稳定其他系统组件的功能。
本页内容
封闭步骤的目的和功能
蛋白质印迹法中使用的膜支持物（如硝酸纤维素和聚偏二氟乙烯（PVDF））对蛋白质具有高度亲和性。为了防止在转移后的步骤中检测抗体发生非特异性结合，必须封闭膜表面未占用的位点。封闭缓冲液的配方多种多样，可能含有牛奶、正常血清或高度纯化的蛋白质，用于封闭膜表面的游离位点。封闭步骤必不可少，通过减少背景干扰，可提高检测的信噪比。封闭剂用量不足会导致背景噪音过大，信噪比降低；相反，封闭剂浓度过高可能会掩盖抗体-抗原相互作用或抑制标记酶，从而导致目标信号减弱。
封闭缓冲液的类型
已有多种封闭缓冲液成功用于蛋白质印迹法。大多数蛋白质印迹封闭缓冲液是惰性溶液，由混合蛋白或单一纯化蛋白组成，与印迹上的检测抗体或抗原几乎或完全没有相互作用。封闭剂通常在含有或不含洗涤剂的Tris缓冲盐溶液（TBS）或磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中稀释。可以在封闭缓冲液中添加 Tween-20 等去污剂，以进一步减少非特异性结合。Tween-20 的用量（0.05%-0.2%）取决于所用抗体的强度。在后续洗涤过程中，过量的去污剂可能会将结合力弱的抗体洗掉。
| 封闭缓冲液/封闭剂 | 优势 | 注意事项 |
|---|---|---|
| 2-5% 脱脂牛奶 | 价格低廉，含有多种蛋白质 | 含有生物素和磷蛋白，会影响链霉亲和素-生物素检测策略和磷酸化靶蛋白的检测。由于牛奶中含有多种蛋白质，可能会掩盖一些抗原，降低蛋白质印迹法的检测限。 |
| 2-3%牛血清白蛋白（BSA） | 牛奶的替代品，可用于生物素-链霉亲和素系统或磷蛋白检测 | 市面上有不同等级的 BSA，它们会影响信噪比。BSA 通常是一种较弱的阻断剂，会导致非特异性抗体结合增加，但可以提高低丰度蛋白的检测灵敏度。 |
| 纯化蛋白（如酪蛋白） | 与血清或牛奶溶液相比，单蛋白封闭缓冲液与检测成分发生交叉反应的几率更低。当非脂牛奶等封闭剂阻碍抗原-抗体结合时，这是理想选择 | 比传统的脱脂牛奶配方更昂贵。 |
使用哪种封闭缓冲液？
蛋白质印迹法中封闭缓冲液的选择通常取决于系统。选择合适的封闭缓冲液有助于提高系统的信噪比。有时，当从一种底物切换到另一种底物时，可能需要更换封闭缓冲液，以避免信号减弱或背景增强的问题。例如，在使用碱性磷酸酶（AP）结合物的应用中，应选择Tris缓冲盐溶液（TBS）作为封闭缓冲液，因为磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）会干扰 AP 活性。对特定系统使用的各种封闭缓冲液进行实验测试有助于获得最佳结果。没有一种封闭剂适用于所有应用，因为每种抗体-抗原对都有其独特的特性。
附图说明了测试不同封闭缓冲液作为蛋白质印迹法优化的一部分的价值。在这些实验中，在其他条件相同的情况下，不同的封闭缓冲液可以增强或降低蛋白质印迹法对单个蛋白质的敏感性和特异性。在其他情况下，弱封闭缓冲液可能会导致非特异性条带。
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2％ BSA、5％ NF-Milk 和 StartingBlock 封闭缓冲液在 pAKT 检测中的比较。方法：将 293T 细胞裂解物以 10 μg/孔为起始稀释系列加入 Bolt 4–12% Bis-Tris-Plus 凝胶中，在 200 V 下电泳约 20 分钟。使用 iBlot 2 凝胶转移装置将凝胶转移到硝酸纤维素膜上（P0 方案 7 分钟）。使用 Bandmate 自动化蛋白质印迹处理器进行免疫印迹处理。用 2% BSA（PBS）、5% 脱脂牛奶（PBS）或 StartingBlock 封闭缓冲液封闭膜。用兔抗 pAKT（1:1,000，货号：MA5-14916）在适当的封闭缓冲液中稀释，对膜进行检测。随后用 HRP 偶联山羊抗兔 IgG（1:2,500 或 0.04 µg/mL，货号：32460）孵育。使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物进行化学发光检测。在 iBright 成像系统上对膜进行成像。
在检测 293T 细胞裂解物中的 pAKT 时，2% BSA和 StartingBlock 封闭缓冲液提供了最高的灵敏度。然而，2% BSA 对检测抗体非特异性结合的封闭效果较弱，这表现为在较高的总裂解液加样量下出现非特异性条带模式。5% NF-Milk 提供了最低的背景，但是以检测限为代价。
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方法：将 293T 细胞裂解物以 10 μg/孔为起始稀释系列加入 Bolt 4–12% Bis-Tris-Plus 凝胶中，在 200 V 下电泳约 20 分钟。使用 iBlot 2 凝胶转移装置将凝胶转移到硝酸纤维素膜上（P0 方案 7 分钟）。使用 Bandmate 自动化蛋白质印迹处理器进行免疫印迹处理。用 5% BSA（PBS）、5% 脱脂牛奶（PBS）、1% 酪蛋白（PBS）或 StartingBlock 封闭缓冲液封闭膜。用在适当的封闭缓冲液中稀释的兔抗 Hsp90（1:5,000，货号：MA1-10372）探测膜。随后用 HRP 偶联山羊抗兔 IgG（1:1,000 或 0.01µg/mL，号：32460）孵育。使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物进行化学发光检测。在 iBright 成像系统上对膜进行成像。
在检测 293T 细胞裂解液中含量丰富的 Hsp90 时，所有经过测试的封闭缓冲液都能提供合理的信噪比。5% BSA 对检测抗体表现出较高的非特异性结合，但灵敏度良好。
荧光蛋白质印迹法的注意事项
封闭缓冲液和洗涤缓冲液中的颗粒和污染物可能会沉淀在膜上，产生荧光伪影，因此在荧光蛋白质印迹法中必须使用高品质的过滤缓冲液。此外，在封闭步骤中应尽量少用洗涤剂，因为普通洗涤剂可能会自动发光，从而增加非特异性背景。
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方法：将 A431 细胞裂解物以 15 μg/孔为起始稀释系列加入 Bolt 4–12% Bis-Tris-Plus 凝胶中，在 200 V 下电泳约 20 分钟。使用 iBlot 2 凝胶转移装置将凝胶转移到硝酸纤维素膜上（P0 方案 7 分钟）。用 FL 封闭缓冲液、5% 脱脂牛奶（TBS）或其他专用封闭缓冲液封闭膜。用 抗EGFR、抗 Stat3 或抗 Ras10 抗体在适当的封闭缓冲液中稀释，然后探查膜。随后用 Alexa Fluor Plus 800 偶联山羊抗兔 IgG 和 Alexa Fluor Plus 680 山羊抗鼠 IgG 进行孵育。在 iBright 成像系统上对膜进行成像。
推荐的 Thermo Scientific 蛋白质印迹封闭缓冲液
| 何时选择 | Thermo Scientific 产品 | 封闭剂 | 产品优势 | 何时使用 | 可提供的规格 |
|---|---|---|---|---|---|
| 化学发光蛋白免疫印迹 | |||||
| 优化新的蛋白质免疫印迹系统 | StartingBlock 封闭缓冲液 | 单一纯化蛋白，不含血清和生物素 |
|
| PBS TBS PBST TBST |
| 传统的封闭剂灵敏度不够 | 封闭剂酪蛋白 | 纯化酪蛋白 |
|
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| 靶向磷蛋白或需要极高水平的灵敏度 | 封闭剂 BSA | 纯化 BSA |
|
| |
| 荧光蛋白质印迹法 | |||||
| 进行荧光蛋白质检测 | 封闭液 FL 荧光封闭缓冲液（10倍） | 单一纯化蛋白 |
| 干燥荧光印迹的成像和储存 | 10 倍浓缩液 |
其他可用封闭缓冲液
| 封闭剂 | 产品优势 | 何时使用 | 可提供的规格 | |
|---|---|---|---|---|
| Pierce Clear 牛奶封闭缓冲液 | 澄清且稳定的牛奶蛋白 |
|
| 硼酸盐，pH 7.6 |
| 鱼血清封闭缓冲液 | 鲑鱼精血清 |
|
| PBS |
| SuperBlock 封闭缓冲液 | 不含血清和生物素的单一纯化糖蛋白 |
|
| PBS TBS PBST TBST |
| 封闭剂 BLOTTO | 脱脂奶粉 |
|
| TBS |
| 不含蛋白质的封闭缓冲液 | 封闭缓冲液的成分不含蛋白 |
|
| PBS TBS PBST TBST |
| Pierce 快速封闭缓冲液 | 单一纯化蛋白 |
|
| TBS |
推荐阅读
- DenHollander, N, Defus D. (1989) Loss of Antigen from Immunoblotting membranes（免疫印迹膜上的抗原丢失）. J Immunol Methods 122(1):129-35.
其他资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。