交联蛋白质相互作用分析

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这篇文章重点阐述了使用交联剂分析蛋白质-蛋白质相互作用。有关交联剂和蛋白交联的更充分讨论，请参阅 《交联和蛋白修饰概述》 以及其中参考的其他文章。

化学交联剂

交联试剂 通过在两个或多个生物分子上的特定氨基酸官能团之间因其相邻端相互作用形成化学键，从而将相互作用蛋白，结构域或肽共价连接到一起。市售交联试剂具有多种特性，包括：

• 官能团特异性—交联剂分子携带靶向胺，巯基，羧基，羰基或羟基的反应性部分。
• 同型双功能或异型双功能—分子的两端具有相同的反应部分[称为同型双功能分子；如下所示的上层分子 (A/A) ,例如 DSS]，可交联相同的残基，而异型双功能交联剂上每个反应基团靶向不同蛋白上的不同官能团，以获得更大的变异性或特异性，如以下下层分子所示（A/B，例如 SMCC）。

DSS 的化学结构。

SMCC 的化学结构。

• 可变间隔臂长度—反应性基团由交联剂分子结构在空间上分离，这允许不同距离的氨基酸交联，如下所示 Sulfo-EGS 与 BS3。也提供零长度交联剂，用于交联两种氨基酸残基，而不会在反应完成后留下相互作用中的任何交联剂分子残留部分。

BS3 的化学结构。

• 可裂解或不可裂解—交联剂分子也可设计为包括可裂解元素，如酯或二硫键（如下图所示 DSP），分别通过添加羟胺或还原剂逆转或破坏连接。

DSP 的化学结构。

• 水溶性或不溶于水—交联剂可能具有疏水性，允许进入疏水性蛋白结构域 (DSS) 或通过细胞膜或亲水性，以便限制交联至水性隔室 (BS3)。

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除了一些蛋白质-蛋白质相互作用的短暂性和有时暂定性之外，这些复合物的形成可能会对任何数量的刺激作出反应，包括 pH 值，温度和渗透压的变化，以及缺乏特定蛋白质或共因子，或引入通常不与该蛋白质相互作用的蛋白质。

体内 交联的优势是可在其天然环境中捕获蛋白质-蛋白质相互作用，从而限制假阳性相互作用或细胞裂解过程中破坏复合物稳定性的风险。对于 体内 交联，如果靶蛋白在细胞膜内或跨过细胞膜，则有望使用疏水性、脂溶性交联剂，而亲水性、水溶性交联剂可用于交联细胞表面蛋白，如受体-配体复合物。该代表性数据提供了 用于体内 交联的各种试剂的一个例子。

几种 体内 交联方法的对比在淬灭前，用 PBS 中的 1％ 甲醛 (HCHO) 或 1 mM 同型双功能 NHS-酯交联剂 （Thermo Scientific DSG 和 DSS）处理 HeLa 细胞 10 分钟。根据步骤，对第四组 HeLa 细胞进行处理并 与 4 mM Photo-亮氨酸、2 mM Photo-蛋氨酸  (Photo-AA) 交联 10 分钟。分别用 100 mM 甘氨酸 (pH 3) 和 500mM Tris (pH 8.0) 对经甲醛处理的细胞和经 NHS–酯处理的细胞进行淬灭)，用时 15 分钟。然后将每种实验条件下的 100 万细胞裂解，在含 50 mM DTT 的还原缓冲液中将每个样品中的 10 μg 细胞在 65°C 下加热 10 分钟，随后使用 SDS-PAGE 和 Stat3 特异性抗体进行 Western blot 分析（细胞信号传导）。使用 GAPDH (Santa Cruz) 和 β-actin (US Biologicals) 作为内参进行 Western Blot 分析。

由于细胞中蛋白浓度高，通常建议将间隔臂较短的交联剂用于 体内 交联，以提高偶联实际相互作用蛋白的特异性，而不是与交联剂孵育期间恰好在彼此附近的蛋白。

尽管 体内 交联可以产生生理相关、稳定交联、用于分析的复合物，但优化这种方法可能很困难，因为反应条件无法严格控制，交联剂可与所有存在交联剂特定反应的官能团的各种蛋白发生反应。

体外 交联可更好地靶向特异性交联事件，因为可以严格控制更多的反应条件，包括 pH 值、温度、反应物浓度和靶蛋白纯度。由于蛋白质-蛋白质相互作用的分辨率更高，控制偶联实验的各个方面的能力可实现更好的分析。此外， 体外 偶联方法允许研究人员修饰相互作用蛋白，如添加聚乙二醇基团（聚乙二醇化），封闭巯基或将胺转化为巯基。此外，有更多的疏水性和亲水性交联试剂可应用于 体外 。使用胺反应性交联试剂 DSS， BS3和 DSSO生成该代表性数据。

通过 SDS-PAGE 法比较 BSA 交联效率。 当蛋白质的交联剂摩尔过量（例如 20，100 或 500 倍）时，将不同交联剂与 BSA 一起孵育。通过 SDS-PAGE 测得的迁移率下降程度，揭示交联效率，具体数值因交联剂类型、水溶性和浓度而不同。

显然，使用 体外 方法偶联蛋白的缺点是缺乏生理条件。此外，细胞膜破裂和溶解会破坏蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-细胞膜相互作用。

由于市售的许多交联试剂均可用于多种不同的应用，因此决定在 体内 或 体外 交联中使用的关键决定因素是靶蛋白，特别就其名称而言：

• 细胞位置—体内 交联会有利于包埋在细胞膜中的蛋白靶标，而细胞质蛋白则可以通过两种方法进行交联，这取决于下一个决定因素。
• 相互作用稳定性—由于细胞裂解以及与其他蛋白质的潜在竞争，较弱的蛋白质-蛋白质相互作用可能会在 体外 交联过程中丢失，而稳定的相互作用可能足够强，可以承受这些力。

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正确识别蛋白质-蛋白质相互作用，首先需要选择理想的交联剂才能使用。因为有多个氨基酸官能团可以与不同的交联剂反应，所以应首先实施筛选多种类型交联剂的经验策略以鉴别靶蛋白偶联物。所测试的交联剂可能不同：

• 疏水性
• 反应性基团
• 同型双功能与异型双功能
• 间隔臂长

一旦通过以下任何方法检测到靶点相互作用，就可对方案进行微调，以通过调整交联剂浓度，pH 值和其他反应条件来优化检测。

应根据经验分别测定 体外 和 体内 交联方案中起始蛋白浓度或细胞数量。对于 体外 交联，蛋白质溶液应在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 等非反应性缓冲液中制备，该缓冲液的 pH 值适合特定交联剂。对于 体内 交联应用，细胞应处于生长的指数级增长期，并且在交联过程中具有亚融合密度。为避免培养基与交联剂发生反应的可能性，可通过一系列细胞洗涤将培养基更换为 PBS。

应按照制造商的说明制备交联剂；疏水性交联剂首先溶解于适当的溶剂，如甲醇或丙酮。要添加的试剂的理想量也取决于交联剂，但通常摩尔过量 20 至 500 倍（相对于裂解物蛋白浓度）适宜。确保反应缓冲液的 pH 值对交联剂有利。大多数胺反应性交联剂活性需要碱性 pH。

根据实验和所用的交联剂，交联反应时间也可能很重要。虽然 30 分钟是开始培养的良好时间，但可同时进行多项实验，以检测其他时间长度，从而确定采用特定交联剂的理想孵育时间。通常应避免长孵育期，不仅因为它可能会导致形成大的交联蛋白聚集体，而且由于交联剂可能会失去稳定性。但是，如果需要延长孵育时间，可以在整个程序的特定时间点添加新鲜交联剂，以保持适当的试剂摩尔比值，最大限度形成靶标产物。尽管如此，在确定最佳反应时间时也应考虑由于广泛交联而形成的聚集体。

通过用于蛋白质-蛋白质相互作用分析的大多数胺反应性交联剂，可以在所需的时间内添加过量的亲核试剂（如 Tris 或甘氨酸），这些试剂会使裂解物蛋白与交联剂发生反应。然后可以通过多种方法纯化交联产物，包括沉淀，色谱分析，透析或超滤。

在凝胶电泳准备中，将淬灭反应和变性蛋白结合在一起的快速方法是加入十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 缓冲液，该缓冲液同时含有 Tris 和 2-Mercatpo乙醇，然后将溶液煮沸 5 分钟。然后可通过凝胶电泳直接分析样品。

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交联通常用于捕获和稳定瞬时或不稳定相互作用，因此可以通过电泳，染色，Western 印迹，免疫沉淀或免疫共沉淀和质谱等下游方法进一步分离和分析。

免疫印迹

当两种蛋白质共价交联时，与未交联的蛋白质相比，这两种蛋白质的凝胶迁移模式发生变化。因此，如果有检测每个靶蛋白的抗体，检测相互作用蛋白变化的最直接方法是采用 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。

免疫沉淀和免疫共沉淀 (co-IP)

免疫沉淀 (IP) 和 免疫共沉淀 (co-IP) 都 是分别通过亲和纯化检测蛋白表达和蛋白间相互作用的方法。交联通常在两种应用中进行，无论是单独还是与亲和结合共同进行以将抗体固定到微珠状支持物上，还是冻结抗体与抗原之间微弱的相互作用力以防止在提取免疫复合物样品过程中丢失样品。交联还用于在 co-IP 方案之前稳定瞬时或较弱的蛋白间相互作用。按照这两种方法，通常使用 SDS-PAGE 分析样品。

细胞周期蛋白 B 和 Cdk1 的免疫共沉淀。  Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠 与 Cdk1 复合的 Cdk1 抗体结合。细胞周期蛋白 B 与 Cdk1 结合，并与其结合配体一起被捕获。

如果可以采用 质谱分析 (MS) 进行检测，则可以通过所连接的交联剂分子导致的质量变化来识别相互作用的蛋白之间交联的肽片段。在这种方法中，同质样品与氘化（重质）或非氘化（轻质）交联剂交联。然后将交联蛋白混合，并通过 MS 分析，以根据其轻质产物的变化来鉴别和定量重质产物。该方法通常还采用 SDS-PAGE 作为在准备 MS 分析时进行酶切之前的第一阶段纯化步骤。

BSA 交联肽光谱。通过 MS2-MS3 方法和使用 DSSO 交联剂的 XLinkX 鉴别 BSA 交联肽光谱。 XlinkX 软件使用 MS 可切割交联剂 (紫色注释) 的独特碎片离子模式来检测和过滤交联肽以进行交联数据库搜索。

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