Luciferase Reporters

光发射已被用于检测生物学检测中的实验变化近 100 年 (1) ，尽管使用发射光作为检测策略的应用种类繁多，但发射光的类型却各不相同。发光是指由于化学反应而产生的光发射，过程中不伴随热量的产生或任何热变化。这种光与白炽光明显不同，后者会产生热量，这也是白炽灯泡在使用过程中会发热的原因。发光可以分为两种类型：

• 生物发光 - 从生物来源发射的光
• 化学发光 - 由于化学反应而从非生物来源发射的光

生物发光与荧光

荧光是生物学研究中常用的另一种发射光类型，它是由荧光基团产生的。荧光基团是一种分子，能够吸收来自光源的能量，然后发射不同波长处的光。另一方面，生物发光与荧光不同，生物发光的激发能量是通过酶促反应提供的，而不是来自光源。虽然生物发光和荧光都广泛用于科学应用，但由于生物发光报告基因的酶促特性，生物发光报告基因显示出超灵敏的检测能力并且比荧光报告基因具有更宽的动态范围。

生物发光与荧光生物发光（左）分别从萤光素酶（如萤火虫荧光素酶）及其底物（如荧光素）的反应中发射出来。辅因子需求（如ATP、O2）会根据所使用的荧光素酶而有所不同。荧光（右）是荧光基团（例如 FITC ， Alexa Fluor 染料）从光源中吸收能量并在不同波长下发射光能的产物。

与生物发光报告基因相比，荧光报告基因容易发生光漂白，量子产率低，且在基于细胞的检测中的蛋白质稳定性更高，这使得它们不如生物发光报告基因适合用作实时报告基因细胞组分还具有自发荧光特性，可增加非特异性本底信号，从而降低荧光检测在基于细胞的检测中的灵敏度。相反，细胞组分本身不具备生物发光特性，这使得生物发光检测具有更高的灵敏度。

但是，荧光报告基因比生物发光蛋白更适用于在活细胞中可视化靶标，因为荧光基团不需要辅因子或外源性底物即可产生活性，且比生物发光报告基因更稳定。

自然界中的生物发光

生物发光在自然界中的用途非常多样，既通过细菌和夜光藻等单细胞生物表现，也通过鱼类和昆虫等高阶生物表现。生物发光可由陆生生物和水生生物利用，但生物发光在海洋动物中更为常见，特别是那些生活在深海极端环境的动物。生物发光使这些生物具备许多自然功能。

防御： 猎物可以利用强烈的生物发光信号作为武器，暂时致盲捕食者，从而使猎物有机会逃脱。猎物发出的光也会使潜在捕食者面临被其他捕食者探测到的危险。

伪装： 通常栖息在海洋黑暗区域的动物，包括萤火虫鱿鱼、磷虾、狗鲨、花刀鱼和灯笼鱼等，会在夜间浮出水面觅食。这些动物利用反照明来与周围被月光照亮的区域融为一体。某些浅水区的鱿鱼物种也使用类似的伪装，它们通过发光与月光融为一体。

捕食 捕食者常常利用生物发光来吸引猎物。例如，琵琶鱼通过一根伸长的背部鳍棘吸引猎物，脊椎上支撑着一个发光器官，内含生物发光细菌。另外，一些章鱼物种，包括 发光吸盘章鱼，它们的吸盘上排列着能产生蓝绿色光的器官，这些光也用于吸引猎物。

交配： 萤火虫、发光虫等陆生动物和 乍波蛸章鱼 等海洋动物利用生物发光来吸引配偶。

生物发光反应

生物发光反应的发生需要两个关键成分：荧光素酶，即催化反应的酶，和荧光素酶底物。已发现多种荧光素酶，而所有这些酶的发光反应机制大致相同，即在氧气 (O₂ ) 存在下，荧光素酶底物经过氧化脱羧反应，产生光子发射（光）。

荧光素酶很可能在历史的不同阶段经历了进化，形成了在表达模式、底物特异性、辅因子需求和酶动力学方面有所不同的酶。这些进化变化的结果是，一些生物，如细菌和真菌，能够持续发光，而另一些生物则会发出持续时间和强度各异的生物发光闪光。例如，腰鞭毛虫的发光时间较短，仅持续 0.1 秒，而水母的发光则可以持续数十秒。

不同荧光素酶发出的生物发光输出的变化使科学家能够根据其输出动力学对它们进行分类，从而适应不同的实验设计。具有 闪光动力学 的荧光素酶有着最高灵敏度，但发射的光也会快速衰减。相反，具备 辉光动力学 的酶灵敏度较低，但可稳定发光至少 60 分钟。

荧光素酶闪光动力学与辉光动力学。荧光素酶生物发光输出的示意图，以闪光和辉光动力学作为时间函数。RLU ：相对光单位。

荧光素酶在其天然状态下具有活性，一旦发生解折叠或变性，则会丧失活性，这一特性已被用于研究影响蛋白质正确折叠的因素。此外， Gaussia， Metridi 和 Cypridin 等荧光素酶是天然分泌的，因此它们被用于研究分泌途径的机制和调节。

种属特异性荧光素酶特异性、辅因子需求和物理特性。

荧光素酶越来越广泛地用于生物系统 的研究，因为生物发光是一种灵敏的检测方法，且试剂易于使用。生物发光的常规应用领域包括：

• 体内成像
• 细胞增殖检测
• 蛋白质折叠 / 分泌分析
• 报告基因检测

体内 成像                                                                

体内成像是一种相对较新的非侵入性方法，由于有能力示踪小鼠和大鼠等活体动物体内的分子事件，迅速在生物医学研究中获得广泛应用。在动物疾病模型中，细胞、病原体、蛋白质或其他分子可通过生物发光荧光素酶进行标记，并可在局部或全身添加底物后可视化。低强度的光能够穿透组织，穿透的程度取决于发射光的波长。因此，尽管来自实验动物体内深处的生物发光可以通过敏感的检测系统进行检测，但发射光波长为> 600  nm 的荧光素酶在体内成像应用中具有最高灵敏度 (2)。

细胞活性检测

生物发光检测还被开发用于监测细胞活性和增殖。生物发光细胞活性检测试剂盒使用 ATP 依赖性荧光素酶对代谢活性细胞中存在的游离 ATP 进行定量。随着细胞群增殖，产生的可供检测的 ATP 的量会增加，导致群体的生物发光信号同时增加。检测细胞增殖的常用非生物发光方法包括：

• 通过测量滴定胸苷（³H- 胸苷）或溴脱氧尿苷 (BrdU) 摄取对 DNA 合成进行定量
• 使用碘化丙啶（一种膜不可透过性 DNA 嵌入染料）鉴别死细胞
• 采用四唑盐还原法 (MTT) 定量细胞内环境的还原情况。
• AlamarBlue 还原和细胞内 ATP 浓度的定量。

报告基因检测

报告基因检测用于研究控制相关感兴趣基因的表达的基因调控元件。基因由多个功能部分组成，包括指定要合成的蛋白质的编码区，以及控制编码区转录的调控元件。

报告基因检测的核心是将假定的调控元件与报告基因融合，并监测表达的报告基因蛋白数量。因为报告基因的表达受到融合基因元件的控制，因此报告基因的表达与调控元件的活性直接相关。这些元件可以是启动子、增强子或控制细胞内转录或翻译过程的 5’ 或 3’ 非翻译区 (UTR)。

良好的报告蛋白的特征是它应当易于测定或检测，并且在测试系统中通常不存在。报告基因系统的选择也取决于实验系统、灵敏度需求和可用检测策略，检测策略可以是吸光度、荧光或生物发光。传统上用作报告基因的蛋白包括 β - 半乳糖苷酶 (lacZ)、氯甲苯基乙酰转移酶 (CAT)、β - 葡糖苷酸酶 (GUS) 和荧光蛋白（分别为绿色、黄色或红色荧光蛋白 [GFP ， YFP 或 RFP]）和分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)。

荧光素酶检测

基于荧光素酶的报告基因检测具有超高灵敏度的检测能力和宽动态范围，因此被广泛使用。这些检测包括将基因调控元件置于荧光素酶基因上游，然后通过转染、转化或注射将所得的报告基因构建体转移至动物细胞、植物细胞或细菌中。然后，测量荧光素酶报告基因的表达，以定量调控元件（顺式作用）或蛋白质（反式作用）在受靶元件影响的生物学通路中的活性。

荧光素酶报告基因检测示意图。

单光谱与双光谱检测

荧光素酶可以作为单一报告基因用于研究给定实验中的一个生物事件，但由于它们具有不同的光谱特性和/或底物，因此可以将多种荧光素酶组合用于多重荧光素酶实验。这类实验称为双光谱荧光素酶报告基因检测，通过这些试验，可在单个样品中同时表达和检测两种荧光素酶。双光谱荧光素酶报告基因检测试剂盒适用于：

• 在每次筛查中分析多个靶点
• 减少脱靶效应
• 识别两条或多条途径之间的串扰
• 对数据进行归一化，以消除实验伪影

在数据归一化实验中，一个报告基因通常用作实验报告基因，第二个报告基因用作内部对照，用于解释由于操作错误或生物操作、细胞处理的非特异性效应导致的实验偏差。其他实验偏差包括：

• 细胞接种差异
• 由于实验处理导致的细胞活性或增殖差异
• 由于细胞培养箱中环境条件不均匀导致的边缘效应
• 处理化合物对报告基因本身功能的非特异性影响

测量策略

双谱荧光素酶报告基因检测使用的荧光素酶具有不重叠发光光谱，可以通过基于滤光片的检测，针对单个样本使用单个试剂同时测量两种荧光素酶的发光信号。市面上已经可以购买此类使用相同或不同底物的双报告基因检测试剂盒。

当使用具有重叠光谱的荧光素酶时，如果它们具有不同的底物特异性，可通过两步法，使用两种试剂，按顺序进行检测。在两步法中，首先测量第一种荧光素酶的发光信号，然后使该酶失活。然后加入含有第二种荧光素酶底物的第二种试剂，并测量其活性。理论上，对于两种以上的酶，只要酶具有不同的底物特异性，就可以通过这种方式进行多重检测。

不同荧光素酶的光谱分辨率。注：红色萤火虫的发光向右移动，使其能够与其他荧光素酶一起进行多重检测。

双光谱荧光素酶检测组合和多重检测策略。

使用双光谱荧光素酶检测法的时间进程分析试验

双光谱荧光素酶检测试剂盒对于时间进程分析试验较为理想，时间进程分析试验中，使用分泌型荧光素酶来测量实验启动子的活性，同时使用受管家基因启动子控制的细胞内荧光素酶来测量细胞的活性。实验启动子活性致使荧光素酶分泌至培养基中，这些培养基将在整个实验的不同时间点进行收集。在时间进程分析试验结束时，细胞会裂解，将测量裂解物中的细胞内荧光素酶活性，作为细胞活性的对照。

并非所有市售的双光谱荧光素酶检测试剂盒都适用于时间进程分析实验，因为它们要求使用分泌型荧光素酶报告基因。例如，  海肾荧光素酶不会分泌，因此 Pierce 海肾萤火虫荧光素酶双报告基因检测试剂盒不适用于这种时间过程试验。但是， 海萤 和 Gaussi 类荧光素酶会分泌；因此，Pierce 海萤萤火虫和 Gaussia 萤火虫双光谱荧光素酶试剂盒与时间进程分析试验兼容。

海萤- 萤火虫荧光素酶双检测试剂盒的工作流程

1. Keilin D. (1966) The history of cell respiration and cytochrome.Cambridge, Cambridge U.P. xx, 416.
2. Negrin R. S. and Contag C. H. (2006) In vivo imaging using bioluminescence: A tool for probing graft-versus-host disease.Nat Rev Immunol.6, 484-90.
3. Smith K. C. (1989) the science of photobiology.New York: Plenum Press.Viii, 426.
4. Campbell A. K. and Herring P. J. (1990) Imidazolopyrazine bioluminescence in copepods and other marine organisms.Marine Biology.104, 219-25.
5. Robison B. H. and Young R. E. (1981) Bioluminescence in pelagic octopods.Pacific Science.35, 39-44