RT-qPCR 基本原理

定量反转录聚合酶链式反应，也称为 RT-qPCR ，用于检测和定量 RNA。 总 RNA 或 mRNA 首先转录成互补 DNA (cDNA)。随后使用 cDNA 作为定量 PCR 或实时 PCR 反应 (qPCR) 的模板。在 qPCR 中，在每个 PCR 循环中使用荧光测量扩增产物的量。RT-qPCR 用于多种应用，包括基因表达分析、RNAi 验证、微阵列验证、病原体检测、基因检测和疾病研究。

RT-qPCR 可以按一步法或两步法进行（图1、表1）。一步法检测是在一个反应管和缓冲液中进行反转录和PCR，同时使用反转录酶和 DNA 聚合酶。一步法 RT-qPCR 仅使用序列特异性引物。在两步法中，反转录步骤和 PCR 扩增步骤在独立的管中进行，采用不同的优化缓冲液、反应条件和引物策略。

图 1.一步法与两步法 RT-qPCR。

更多了解：一步法与两步法 RT-qPCR

在设计 RT-qPCR 实验时，决定使用总 RNA 还是mRNA 作为反转录模板非常重要。尽管 mRNA 可能提供稍高的灵敏度，但通常使用总 RNA， 因为它比 mRNA 作为起始材料具有重要的优势。首先，需要较少的纯化步骤，这有助于确保模板的定量回收率更高，并且能够更好地将结果归一化到起始细胞数量。其次，通过避免任何 mRNA 富集步骤，可以避免因不同 mRNA 的回收率不同所致的结果偏差。总之，总 RNA 更适用于大多数情况，因为对于大多数应用，靶标的相对定量比绝对检测灵敏度更重要 [1]。

探索：总 RNA 分离

要启动反转录，需要一个短 DNA 寡核苷酸作为引物，与模板 RNA 链退火结合，并为反转录酶提供一个合成的起点。在两步法的 cDNA 反应中，可以采用四种不同的引物方法：Oligo (dT) 引物、随机引物或序列特异性引物（图 2 和表 2）。通常使用 Oligo (dT) 和随机引物的混合物。将随机引物和锚定 Oligo (dT) 引物 结合，减少截断型 cDNA 生成，有助于提高反转录效率和 qPCR 灵敏度。

表 2.RT-qPCR 的 cDNA 合成步骤的引物考虑因素

探索：反转录引物

反转录酶 (RT) 是从 RNA 合成 DNA 的酶。一些反转录酶具有 RNase 活性，可在转录后降解 RNA-DNA 杂交体中 RNA 链。如果酶没有 RNase 活性，则可以添加 RNase H 提高 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒反转录酶。对于 RT-qPCR，理想的选择是热稳定性高的反转录酶，因为这种酶允许在较高温度合成 cDNA，有助于确保具有高水平二级结构的 RNA 的成功转录，同时在整个反应过程中保持其充分活性，以帮助得到更高 cDNA 产量。

探索：反转录酶

RNase H 活性从 RNA-DNA 双链中降解 RNA，从而实现高效合成双链 DNA。然而，对于长 mRNA 模板，RNA 可能过早被降解，这可能产生截断型 cDNA。因此，当旨在产生用于 cDNA 克隆的长转录本时，通常最好能尽量减低 RNase H 活性。相反，具备固有 RNase H 活性的反转录酶往往在 qPCR 应用中受青睐，因为它们可以在 PCR 的前几个循环中增强 RNA-DNA 双链解链（图 3）。

了解更多信息：反转录酶特性

用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物理想情况下应设计成跨越外显子-外显子连接区，其中一个扩增引物可以跨越实际的外显子-内含子交界（图 4）。这种设计有助于降低因污染基因组 DNA 扩增而产生的假阳性风险，因为含有内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增。

在所有 RT-qPCR 实验中，都应包含一个阴性反转录酶对照（“无RT”对照），以检测是否存在污染的DNA（如基因组DNA或前一次PCR实验的产物）。这种对照包含除反转录酶之外的所有反应组分。反转录不应在对照中发生，因此如果看到 PCR 扩增，则它极有可能源自污染 DNA。

1. Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.