赛默飞质谱研究助力病毒研究

2020年初,新型冠状病毒疫情汹涌来袭,严峻的疫情形势牵动着每一个国人的心。在这个没有硝烟的战场,白衣天使们义无反顾冲锋在前,实验室中越来越多的临床研究工作者也前赴后继加入疫情研究中。
其中挖掘病毒侵染宿主机理,寻找关键致病因子变得尤为重要,为后期开发疫苗及药物在根本上打赢这场战役做出贡献。然而挖掘分子层面的关键信息,必须依靠高灵敏度,高通量,高准确度的方法,而液质联用技术正是解决该问题的平台,赛默飞依托Orbitrap高分辨及三重四极杆高准确度质谱技术,正在疫情研究中起到关键作用。

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 赛默飞病毒研究液质联用解决方案

2019年Viruses杂志上发表了基于组学技术研究宿主变化的综述,质谱技术中基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行MS分析(AP-MS)的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒-宿主多蛋白复合物,可识别间接和直接的蛋白质相互作用,提供相互作用事件的瞬时信息,或跟踪单个病毒基因产物的过表达,以深入了解单个蛋白质的功能;表达蛋白质组学技术(定量蛋白质组学和翻译后修饰组学)可以研究病毒蛋白的组成,宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化。
(Viruses 2019, 11, 878; doi:10.3390/v11090878)

Orbitrap技术优势

高通量:识别数量惊人的病毒-宿主蛋白关联,基于这些数据构建了包含了5000多种病毒成分和宿主细胞之间的非冗余蛋白相互作用数据库。

寨卡病毒(ZIKV)最近成为全球健康问题,由于它的广泛传播和与严重的联系新生儿神经症状和小头症。然而,与致病性相关的分子机制关于ZIKV的大部分仍然未知。

利用赛默飞 LTQ-Orbitrap和Orbitrap Q Exactive HF质谱进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学(实验路线见下图a),研究对象为神经细胞系SK-N-BE2和NPC细胞,表征细胞对病毒的反应,在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化,利用亲和蛋白组学方法鉴定ZIKV蛋白的细胞靶点。使用这种方法,找到了386个与zikv相互作用的蛋白质,导致宿主在神经发育受损,视网膜缺陷和不孕。此外,确定了寨卡病毒感染后1216个磷酸化位点存在上调或下调,来自AKT, MAPK-ERK和ATM-ATR信号通路中,为防范ZIKV感染扩散提供机制基础。在功能上,系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动,并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证(下图热图),补充这一空白。
(Pietro, Scaturro, Alexey, et al. Nature, 2018)

Orbitrap技术优势

高准确度:提供更准确的相对蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学定量数据,为后续发现信号通路中关键变化,为防范ZIKV感染扩散提供机制基础。

随着科学家深入研究发现ZIKV感染的激增与格林-巴利综合征和小头症的显著增加有关。尽管大量的宿主蛋白已经在物理和/或功能上与其他黄病毒相联系,但对ZIKV建立的病毒-宿主蛋白相互作用知之甚少。

本文利用生物素识别以及IPMS亲和纯化结合MS 方法,研究寨卡病毒侵染后病毒与宿主细胞蛋白质的相互作用(技术路线见上图),实验结果揭示了1224个蛋白3033多肽形成的相互作用网络(见下图a)。相互作用包括多肽加工和质量控制、囊泡方面的作用运输,RNA处理和脂质代谢。通过数据挖掘分析,揭示过氧化物酶体在ZIKV感染中的关键作用。
(Etienne Coyaud, et al.  Molecular & Cellular Proteomics,2018)

Orbitrap技术优势

高灵敏度:揭示了相互作用网络。40%的作用都是以新报道的相互作用。

精确的质量分析可以提供有用的信息化学计量学和蛋白质颗粒的组成,如病毒组装。准确的质量分析为研究病毒的蛋白组装过程提供重要的信息。

本文使用Orbitrap高分辨质谱仪测定高达4.5MDa病毒样颗粒,并精准检测装载8至12种蛋白后的细菌胶囊颗粒的分子量,确定加载蛋白的具体数目。此外利用Native MS技术确定腺相关病毒衣壳蛋白的三种不同剪接变体的未知化学计量,表明对称性被破坏且病毒装配过程具有异质和随机性。这些结果证明Orbitrap高分辨质谱在基于蛋白质的纳米颗粒分析中的强大能力及在化学生物学和纳米技术中的广泛应用。
(Joost Snijder et al.  JACS,2014)


基于Orbitrap分别对encapsulin, adenovirus dodecahedron, adeno-associated virus serotype 1及
cowpea chlorotic mottle virus(自上而下)分子量的测定

Orbitrap技术优势

高质量范围:测定高达几MDa病毒样颗粒,并精准检测装载十多种蛋白后的细菌胶囊颗粒的分子量,确定加载蛋白的具体数目。
高精准度:确定病毒衣壳蛋白的多种不同剪接变体的未知化学计量,表明对称性被破坏且病毒装配过程具有异质和随机性。

诺如病毒在组织血型抗原(HBGA)上的附着对于感染至关重要,但两者如何结合促进宿主细胞的感染尚不清楚。

本文利用NMR和HDX-MS(Orbitrap Fusion系列质谱仪)技术研究HBGA与流行病毒株Gll.4的P结构域的结合。结果显示两者的结合具有高度的选择性,取决于位于与HBGA结合位点相邻的抗原环中373位的天冬酰胺转化为异天冬氨酸,在生理条件下此抗原自发性翻译后修饰的半衰期持续多天,且与HBGA的存在无关,但严重影响HBGA的识别。该翻译后修饰序列的保守性和位于病毒的表面位置,表明在许多诺如病毒株的感染和免疫识别中起着重要作用。
(Mallagaray A, et al.  Nat Commun,2019)

Orbitrap技术优势

节省成本:无需大量的样本及复杂的晶体制备,对样品要求较低,
高准确性:能够实现从完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平上获得详细信息,使得最终的蛋白质高级结构的信息更加全面和准确。

一项针对于MERS-CoV研究,整合基于Orbitrap 的蛋白质组学,代谢组学和脂质组学的多组学研究发现:通过对蛋白和代谢富集分析,感染MERS-CoV的细胞,包括氧化磷酸化,糖酵解/糖异生,嘌呤等5条代谢途径发生了显著变化;而且糖酵解/糖异生途径中的几乎所有蛋白质在MERS-CoV感染期间的丰度都降低。底物葡萄糖积累表明,糖酵解比糖异生途径更可能受到病毒感染的影响。

进一步结合脂质组学的数据发现,在MERS-CoV感染期间,脂肪酸和鞘脂类发生了广泛的变化。有报道显示,鞘脂在病毒的摄取,复制,成熟和出芽中起着重要的作用,富含神经酰胺的膜结构可通过改变膜液流动性和增强囊泡融合来促进包膜病毒进入宿主细胞,触发宿主细胞凋亡,进一步恶化病情。
(Nakayasu, Ernesto S, et al.  mSystems,2016)

方案优势

平台兼容性:同一平台进行蛋白质组学、代谢组学及脂质组学研究,大大提高数据分析的兼容性。

临床试验中不可缺少的一环就是生物样品分析,通过受试者血浆,血清等生物样本的分析,提供药物在体内药代动力学信息,目前最主要的分析手段是通过液相-串联质谱联用技术。同时,因新冠患者的临床症状,不同的患病人群如孕妇、儿童等的治疗方案存在的不同,液质联用技术可提供治疗药物监测数据,帮助医生调整用药方案和剂量。

本文介绍了利用UPLC-MS/MS(Transcend TLX1-TSQ Altis)同时定量人血浆中阿扎那韦等14种抗逆转录病毒药物和2种联用增效药物Cobicistat and Ritonavir,该方法在6分钟内即可完成对所有化合物的定量检测,并已根据欧洲药品管理局的指导原则进行了充分的方法学。

临床上抗病毒治疗方案中,药物联用是重要的治疗手段之一,因此一个方法中包含多化合物检测是必要的。Transcend TLX1联合TSQ Altis提供的快速样本制备,所有化合物的快速检测,对生物样本分析的时效性提供非常重要的技术支撑,非常适合于临床药代动力学和治疗药物监测研究。
(Helene Gouget, et al.  Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2020)

方案优势

快速:6分钟内即可完成对所有化合物的定量检测,并已根据欧洲药品管理局的指导原则进行了充分的方法学 。

2019年Viruses杂志上发表了基于组学技术研究宿主变化的综述,质谱技术中基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行MS分析(AP-MS)的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒-宿主多蛋白复合物,可识别间接和直接的蛋白质相互作用,提供相互作用事件的瞬时信息,或跟踪单个病毒基因产物的过表达,以深入了解单个蛋白质的功能;表达蛋白质组学技术(定量蛋白质组学和翻译后修饰组学)可以研究病毒蛋白的组成,宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化。
(Viruses 2019, 11, 878; doi:10.3390/v11090878)

Orbitrap技术优势

高通量:识别数量惊人的病毒-宿主蛋白关联,基于这些数据构建了包含了5000多种病毒成分和宿主细胞之间的非冗余蛋白相互作用数据库。

寨卡病毒(ZIKV)最近成为全球健康问题,由于它的广泛传播和与严重的联系新生儿神经症状和小头症。然而,与致病性相关的分子机制关于ZIKV的大部分仍然未知。

利用赛默飞 LTQ-Orbitrap和Orbitrap Q Exactive HF质谱进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学(实验路线见下图a),研究对象为神经细胞系SK-N-BE2和NPC细胞,表征细胞对病毒的反应,在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化,利用亲和蛋白组学方法鉴定ZIKV蛋白的细胞靶点。使用这种方法,找到了386个与zikv相互作用的蛋白质,导致宿主在神经发育受损,视网膜缺陷和不孕。此外,确定了寨卡病毒感染后1216个磷酸化位点存在上调或下调,来自AKT, MAPK-ERK和ATM-ATR信号通路中,为防范ZIKV感染扩散提供机制基础。在功能上,系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动,并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证(下图热图),补充这一空白。
(Pietro, Scaturro, Alexey, et al. Nature, 2018)

Orbitrap技术优势

高准确度:提供更准确的相对蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学定量数据,为后续发现信号通路中关键变化,为防范ZIKV感染扩散提供机制基础。

随着科学家深入研究发现ZIKV感染的激增与格林-巴利综合征和小头症的显著增加有关。尽管大量的宿主蛋白已经在物理和/或功能上与其他黄病毒相联系,但对ZIKV建立的病毒-宿主蛋白相互作用知之甚少。

本文利用生物素识别以及IPMS亲和纯化结合MS 方法,研究寨卡病毒侵染后病毒与宿主细胞蛋白质的相互作用(技术路线见上图),实验结果揭示了1224个蛋白3033多肽形成的相互作用网络(见下图a)。相互作用包括多肽加工和质量控制、囊泡方面的作用运输,RNA处理和脂质代谢。通过数据挖掘分析,揭示过氧化物酶体在ZIKV感染中的关键作用。
(Etienne Coyaud, et al.  Molecular & Cellular Proteomics,2018)

Orbitrap技术优势

高灵敏度:揭示了相互作用网络。40%的作用都是以新报道的相互作用。

精确的质量分析可以提供有用的信息化学计量学和蛋白质颗粒的组成,如病毒组装。准确的质量分析为研究病毒的蛋白组装过程提供重要的信息。

本文使用Orbitrap高分辨质谱仪测定高达4.5MDa病毒样颗粒,并精准检测装载8至12种蛋白后的细菌胶囊颗粒的分子量,确定加载蛋白的具体数目。此外利用Native MS技术确定腺相关病毒衣壳蛋白的三种不同剪接变体的未知化学计量,表明对称性被破坏且病毒装配过程具有异质和随机性。这些结果证明Orbitrap高分辨质谱在基于蛋白质的纳米颗粒分析中的强大能力及在化学生物学和纳米技术中的广泛应用。
(Joost Snijder et al.  JACS,2014)


基于Orbitrap分别对encapsulin, adenovirus dodecahedron, adeno-associated virus serotype 1及
cowpea chlorotic mottle virus(自上而下)分子量的测定

Orbitrap技术优势

高质量范围:测定高达几MDa病毒样颗粒,并精准检测装载十多种蛋白后的细菌胶囊颗粒的分子量,确定加载蛋白的具体数目。
高精准度:确定病毒衣壳蛋白的多种不同剪接变体的未知化学计量,表明对称性被破坏且病毒装配过程具有异质和随机性。

诺如病毒在组织血型抗原(HBGA)上的附着对于感染至关重要,但两者如何结合促进宿主细胞的感染尚不清楚。

本文利用NMR和HDX-MS(Orbitrap Fusion系列质谱仪)技术研究HBGA与流行病毒株Gll.4的P结构域的结合。结果显示两者的结合具有高度的选择性,取决于位于与HBGA结合位点相邻的抗原环中373位的天冬酰胺转化为异天冬氨酸,在生理条件下此抗原自发性翻译后修饰的半衰期持续多天,且与HBGA的存在无关,但严重影响HBGA的识别。该翻译后修饰序列的保守性和位于病毒的表面位置,表明在许多诺如病毒株的感染和免疫识别中起着重要作用。
(Mallagaray A, et al.  Nat Commun,2019)

Orbitrap技术优势

节省成本:无需大量的样本及复杂的晶体制备,对样品要求较低,
高准确性:能够实现从完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平上获得详细信息,使得最终的蛋白质高级结构的信息更加全面和准确。

一项针对于MERS-CoV研究,整合基于Orbitrap 的蛋白质组学,代谢组学和脂质组学的多组学研究发现:通过对蛋白和代谢富集分析,感染MERS-CoV的细胞,包括氧化磷酸化,糖酵解/糖异生,嘌呤等5条代谢途径发生了显著变化;而且糖酵解/糖异生途径中的几乎所有蛋白质在MERS-CoV感染期间的丰度都降低。底物葡萄糖积累表明,糖酵解比糖异生途径更可能受到病毒感染的影响。

进一步结合脂质组学的数据发现,在MERS-CoV感染期间,脂肪酸和鞘脂类发生了广泛的变化。有报道显示,鞘脂在病毒的摄取,复制,成熟和出芽中起着重要的作用,富含神经酰胺的膜结构可通过改变膜液流动性和增强囊泡融合来促进包膜病毒进入宿主细胞,触发宿主细胞凋亡,进一步恶化病情。
(Nakayasu, Ernesto S, et al.  mSystems,2016)

方案优势

平台兼容性:同一平台进行蛋白质组学、代谢组学及脂质组学研究,大大提高数据分析的兼容性。

临床试验中不可缺少的一环就是生物样品分析,通过受试者血浆,血清等生物样本的分析,提供药物在体内药代动力学信息,目前最主要的分析手段是通过液相-串联质谱联用技术。同时,因新冠患者的临床症状,不同的患病人群如孕妇、儿童等的治疗方案存在的不同,液质联用技术可提供治疗药物监测数据,帮助医生调整用药方案和剂量。

本文介绍了利用UPLC-MS/MS(Transcend TLX1-TSQ Altis)同时定量人血浆中阿扎那韦等14种抗逆转录病毒药物和2种联用增效药物Cobicistat and Ritonavir,该方法在6分钟内即可完成对所有化合物的定量检测,并已根据欧洲药品管理局的指导原则进行了充分的方法学。

临床上抗病毒治疗方案中,药物联用是重要的治疗手段之一,因此一个方法中包含多化合物检测是必要的。Transcend TLX1联合TSQ Altis提供的快速样本制备,所有化合物的快速检测,对生物样本分析的时效性提供非常重要的技术支撑,非常适合于临床药代动力学和治疗药物监测研究。
(Helene Gouget, et al.  Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2020)

方案优势

快速:6分钟内即可完成对所有化合物的定量检测,并已根据欧洲药品管理局的指导原则进行了充分的方法学 。

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