抗体制备（免疫原制备）

特异性抗体探针的生产是一个相对简单的过程，涉及动物免疫，并依靠动物免疫系统召集应答而针对注射分子的抗体进行生物合成。即便如此，几个因素也会影响诱导免疫动物产生有用量靶标特异性抗体的概率。抗原必须以尽可能增加动物产生特异性免疫应答的形式和方式制备并递送。这个过程被称为免疫原制备。

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抗体制备 在概念上简单。然而，由于抗体制备取决于这样一个复杂的生物系统 (生物体免疫) ，结果并非可完全预测。单个动物，甚至那些基因相同的动物，将对相同的免疫方案产生独特反应，针对注射抗原产生不同系列的特异性抗体。即便如此，在基本理解免疫系统如何应答注射异物且具备注射样品制备工具的知识后，研究人员可以极大程度地提高获得有用抗体产品的概率。

例如，小分子化合物 (药物或肽) 不够复杂，本身不足以诱导免疫应答或被以可引起特异性抗体产生的方式进行处理。为使与小分子抗原成功产生抗体，这些小分子化合物必须与钥孔血蓝蛋白（KLH）等免疫原性载体蛋白化学偶联。佐剂可与免疫原混合并注射，以增强免疫反应的强度。

本节（关于抗体制备）介绍了载体蛋白偶联、佐剂的使用以及与注射样品制备有关的其他问题。产生、纯化和修饰抗体以用作抗原特异性探针的程序于二十世纪 70 年代和二十世纪 80 年代开发出来，并自 Harlow 和 Lane 1988 年发表其经典著作 "《抗体：实验室手册》" 以来保持相对不变。

免疫系统是一种监测系统，旨在保护宿主免受外来入侵者的侵袭。监测由在整个生物体中循环的蛋白质和细胞介导，以识别和破坏外源细胞、病毒或大分子物质。

免疫保护经由细胞免疫应答和体液免疫应答组成的双重系统提供。细胞免疫应答由 T 淋巴细胞介导且不能通过血清转移从一个个体转至另一个体。体液免疫涉及血清 (抗体) 中发现的可溶性蛋白质，可在输注血清时转移至接收者体内。

脊椎动物生物体的每个细胞在其质膜上表达 I 类主要组织相容性复合体（MHC I）。MHC I 将一种内源性肽抗原呈递至细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）。如果 CTL 的 T 细胞受体与细胞上的 MHC I/肽抗原结合，整个细胞将被破坏。这是对细胞免疫应答的一般描述，基于这些抗原在细胞质膜上的呈递，能够靶向细胞内病原体，如病毒或细菌（非自身病原体）和癌细胞（改变后的自身病原体）。

体液免疫应答靶向细胞外抗原。B 淋巴细胞使用膜 IgM（mIgM）结合天然形态抗原。出现多种 mIgM 和抗原分子的交联（成帽），然后该复合物通过受体介导的内吞作用进入细胞。随后，这种内涵体与溶酶体融合，所得的内吞溶酶体将抗原酶解为小分子肽。内吞溶酶体与含有 II 类主要组织相容性复合体（MHC II）分子的囊泡融合，肽抗原与 MHC II 中的一个裂隙结合。然后，该 MHC II/抗原复合物在 B 淋巴细胞的质膜上表达。随后，辅助性 T 淋巴细胞的 T 细胞受体与 MHC II/抗原结合，T 细胞分泌细胞因子，这些细胞因子向 B 淋巴细胞发出分裂、分化和分泌抗体的信号。没有 T 细胞帮助，体液免疫应答就会停止；事实上，获得性免疫缺陷综合征状态下细胞免疫应答也会停止。

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抗原和免疫原的定义

抗体的成功产生取决于 B 淋巴细胞与辅助性 T 淋巴细胞的结合、加工和抗原呈递，辅助性 T 淋巴细胞向 B 细胞发出信号，使其产生并分泌抗体。抗原是经免疫系统组分鉴定为非自身来源的任何分子。免疫原是一种能够引起免疫应答的抗原，包括通过体液免疫应答产生抗体。所有免疫原均为抗原，但并非所有抗原都是免疫原。区分 "抗原" 和 "免疫原" 这两个术语很重要，因为许多化合物不具有免疫原性，因此为成功产生针对此类抗原的抗体需要在注射前通过化学方式将抗原与已知免疫原结合来使该抗原产生免疫原性。

决定免疫原性的特性 

免疫原性是分子募集免疫应答的能力。具有免疫原性的物质必须具备三个特征：外源性、高分子量和化学复杂性。免疫原需要具备外源性，以使免疫动物无法将该物质识别为 "自身物质"和忽略该物质。通常，生物体中的化合物对同一个体不具有免疫原性，对同一物种或相关物种的其他个体具有少量免疫原性。

免疫原性的第二项要求是高分子量。小分子化合物（MW 小于 1000）如青霉素、黄体酮和阿司匹林以及许多中等分子量分子（MW 为 1000 至 6000）均不具有免疫原性。大多数分子量大于 6000 的化合物具有免疫原性。小于此分子量的化合物通常在 B 淋巴细胞表面与 mIgM 结合，但这些化合物的大小不足以促进 mIgM 分子交联。这种交联通常称为 "成帽" ，是受体介导的抗原内吞作用的信号。

最后，具有免疫原性的化合物需要一定程度的化学复杂性。例如，由于缺乏产生免疫应答所需的化学复杂性，即使是氨基酸和简单多糖的高分子量均聚物，也很少为良好免疫原。

大分子作为免疫原 

可以对四类主要大分子的免疫原性进行某些概括：碳水化合物、脂质、核酸和蛋白质。碳水化合物仅在具有相对复杂的多糖结构或形成更复杂分子（如糖蛋白）的一部分时，才具有免疫原性。脂质通常不具有免疫原性，但可通过与载体蛋白偶联而具有免疫原性。同样，核酸也是较差的免疫原，但在与载体蛋白偶联时具备免疫原性。

因结构复杂性和大小，蛋白质通常是较强的免疫原。鉴于大多数天然免疫原是由蛋白质、碳水化合物或两者的组合组成的大分子，因此不难理解蛋白质具有广泛的免疫原性。虽然肽可能具备抗原所需的复杂性，但其小尺寸通常使其自身作为免疫原效率低下。肽最常与载体蛋白偶联，以确保它们能够诱导免疫应答并产生抗体。

半抗原与抗原决定簇

用作抗原的肽和其他小分子化合物称为半抗原。它们能够作为产生特异性抗体的识别位点，但自身并不能刺激必要的免疫应答。半抗原可以通过将其与合适的载体分子偶联产生免疫原性。

抗原决定簇是抗原上与抗体结合的特定位点。对于非常小的抗原，几乎整个化学结构都可以作为单个抗原决定簇。根据其复杂性和大小，抗原可能会针对多个抗原决定簇影响抗体生成。多克隆抗体是血清免疫球蛋白的混合物，可能与抗原上的多个抗原决定簇共同结合。根据定义，单克隆抗体仅含单个抗体克隆，并且对一个特定抗原决定簇具有结合特异性。

只要化合物以免疫原性形式呈递给免疫系统，就可以针对几乎任何足够独特的化学结构（无论是天然的还是合成的）产生特异性抗体。所得抗体可与由整个分子（例如小分子半抗原）组成，较大分子的特定官能团，蛋白质三级结构中多个氨基酸官能团的独特排列或脂蛋白、糖蛋白、RNA、DNA 或多糖中的任何其他独特结构的抗原决定簇结合。抗原决定簇也可能是细胞结构、细菌、真菌或病毒的一部分。

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免疫原制备载体蛋白

载体蛋白 是用于与肽或其他半抗原偶联的任意蛋白质，这些肽或半抗原不够大或不够复杂，自身无法诱导免疫应答并产生抗体。载体蛋白因较大且复杂，可使偶联的半抗原具有免疫原性，从而产生针对半抗原和载体上抗原决定簇的抗体。许多蛋白质可用作载体，并可基于免疫原性、溶解度和可用的有用官能团进行选择，蛋白质可通过这些官能团与半抗原偶联。两种最常用的载体是钥孔血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）。

在典型的免疫应答中，抗体是由 B 淋巴细胞产生。在大多数半抗原 - 载体系统中， B 细胞会产生对半抗原和载体均具有特异性的抗体。由于针对载体蛋白和半抗原上的抗原决定簇均会产生抗体应答，因此谨慎计划如何从最终免疫血清中对半抗原特异性抗体进行鉴别和纯化非常重要。使用多种不同的载体和一系列半抗原：载体偶联比例制备偶联物有益于形成最佳免疫原。

钥孔血蓝蛋白（KLH）

钥孔血蓝蛋白（KLH）是使用最广泛的载体蛋白。含铜多肽属于一组称为血蓝蛋白的非血红素蛋白，见于节肢动物和软体动物。KLH 与钥孔帽贝（Megathura crenulata）分离。

由于 KLH 源自在进化上与哺乳动物相距较远的一类蛋白质和一组生物，因此对于通常用于产生抗体的动物免疫系统来说非常 "陌生" 。因具有极大尺寸和复杂的结构，该蛋白质也具有高度免疫原性。该分子由 350 kDa 和 390 kDa 亚基组成，这些亚基形成的聚集体范围为 50 至 800 万道尔顿。

每个 KLH 蛋白质分子包含数百个表面赖氨酸基团，可利用各种交联技术将伯胺作为半抗原共价结合的靶标。这些特点使得 KLH 成为一种极具免疫原性且高效的载体蛋白，可用于免疫原制备。尽管大分子蛋白质因溶解度有限有时难以起效，但稳定和预活化配方的商业化供应使其便于使用。

Thermo Scientific Imject 海洋生物养殖钥孔血蓝蛋白（mcKLH）在稳定缓冲液中纯化和冻干。复溶后，混悬液溶液呈乳白蓝色，这是高纯度、非变性 KLH 的特征。

传统上，KLH 是从自然环境中收获的大钥孔帽贝中直接获得。这种方法破坏了这些帽贝居住的敏感海岸线生态系统。目前获取 KLH 的方法对自然栖息地和帽贝属存活的威胁要小得多。大钥孔帽贝在罐中发酵并收获（海水养殖或“海洋生物养殖”），偶尔会被挤取一些液体，类似于人类捐献血液。

蓝载体* 免疫原性蛋白

蓝载体* 蛋白是 似鲍罗螺 血蓝蛋白（CCH）的纯化制品。该大蛋白与常见载体蛋白钥孔血蓝蛋白 (KLH) 具有相同的免疫原性。不过，其溶解度比后者更好，在使用交联法交联肽段、蛋白质和其他半抗原时，它对于缓冲液和 pH 值提供宽范围的选择，使免疫原制备方案具有更大的灵活性。

蓝载体蛋白质是从软体动物 似鲍罗螺中获得的高度纯化的血蓝蛋白。CCH 蛋白由两个相当大的多肽亚基（404 和 351 kDa）构成，这两个亚基即使在不存在二价阳离子的情况下也能形成较为稳定的异双十倍体结构。（与此相反，KLH 则具有一个不太稳定的可溶性同双十倍体结构）。CCH 亚基复杂的分子排列中含有多种重复的抗原结构，会引发由 T 和 B 淋巴细胞介导的强免疫反应。

由于体积较大、复杂性高，KLH 和 CCH 血蓝蛋白都是半抗原抗体和肽抗体生产过程中首要选择的免疫原载体蛋白。此外，研究表明，血蓝蛋白引发的人类和动物的强 DTH 免疫应答对某些类型的癌症存在有益的治疗效果。肿瘤免疫治疗的最新进展正是利用了血蓝蛋白的免疫特性，从而开发出治疗新兴疾病的新型偶联疫苗。

牛血清白蛋白作为载体蛋白

牛血清白蛋白（BSA；67kDa）属于称为白蛋白的血清蛋白类。白蛋白约占血浆蛋白含量的一半，非常稳定且可溶。BSA 比 KLH 小得多，但具有完全免疫原性。它是一种常用的载体蛋白，适用于弱抗原化合物。BSA 以含 59 个赖氨酸残基的单个多肽形式存在，其中 30 至 35 个残基含有能够与偶联试剂发生反应的伯胺。许多羧酸盐基团为 BSA 提供净负电荷（pI 5.1）。Thermo Scientific Imject BSA 是一种高纯度（即组分 V）牛血清白蛋白，复溶后可用于与半抗原偶联，无需透析或进一步纯化。

因易于获得、完全可溶且含有许多可与在聚苯乙烯微板中无法高效包被的小分子交联的官能团，BSA 常用于免疫检测的开发。此外， BSA 是蛋白检测中最常用的标准品，经充分表征的 SDS-PAGE 分子量标志物，广泛用作阻滞剂。这些相同的特性使 BSA 易于用于免疫检测开发，也使其易于用于载体 - 半抗原偶联物的制备和偶联效率检测。然而， BSA 的多重用途还需在抗体筛选程序和最终应用中采取步骤，以避免与载体发生不希望的交叉反应。

鉴于此原因，在将 KLH 作为载体蛋白用于产生抗半抗原的免疫应答后，BSA 通常用作不相关蛋白载体进行抗体筛选和免疫检测。只有在免疫和筛选/纯化步骤中使用不同的载体蛋白才能确保检测半抗原特异性抗体而不是载体特异性抗体。使用 BSA 作为不相关载体蛋白通常可让用户更充分地利用其作为标准品、分子量标志物和阻滞剂的特性

阳离子化 BSA

阳离子化牛血清白蛋白（cBSA） 通过使用过量乙二胺修饰天然 BSA 制备而成，基本上带正电的伯胺封闭了所有带负电的羧基基团。其效果是高度带正电的蛋白质（pI > 11），与天然 BSA 相比具有明显增强的免疫原性。此外，伯胺数量的增加提供了更大量的使用典型交联方法可被交联的抗原分子。

阳离子化 BSA 的制备。使用 EDC 将牛血清白蛋白与过量乙二胺反应。

Mukerheide、Domen 和 Apple 的一系列研究文章（1987 年、1988 年）中报导了载体蛋白阳离子化对免疫应答产生和调节的影响。（请参阅链接的产品页面以获取完整参考文献）。他们的研究中使用 cBSA 作为载体蛋白，所得免疫原刺激的抗体应答比天然形式 BSA 高得多。在体内，抗体应答增加并长时间保持升高。在体外，产生相同程度的 T 细胞增殖所需的 cBSA 少得多。有趣的是， cBSA 引起的免疫应答增强延伸至与其偶联的半抗原或其他蛋白质。例如，在用于将小鼠免疫时，与单独卵清蛋白或卵清蛋白 BSA 偶联物相比，与 cBSA 偶联的卵清蛋白诱导产生了更多的抗卵清蛋白抗体。

卵清蛋白作为载体蛋白 

卵清蛋白（OVA；45kDa）可用作载体蛋白。卵清蛋白也称为卵白蛋白，占鸡蛋清中蛋白质的 75%。卵清蛋白包含 20 个赖氨酸基团，最常用作辅助（筛选）载体，而不是用于免疫，尽管它具有一定的免疫原性。该蛋白还含有 14 个天冬氨酸和 33 个谷氨酸残基，这些残基提供羧基。这些基团可用作与半抗原结合的靶标。卵清蛋白以单个多肽链形式存在，具有多个疏水残基，等电点为 4.63。蛋白质在高于 56°C 的温度下或经电流或剧烈振荡时会发生变性。卵清蛋白为独特的可溶于高浓度有机溶剂 DMSO 的蛋白质，这一特征使其能够与不易溶于水性缓冲液的半抗原偶联。

了解更多信息：应用资料：载体蛋白活化和偶联数据

半抗原 - 载体偶联方法

提供多种将半抗原与载体蛋白偶联的方法。偶联化学方法的选择取决于半抗原中可用的官能团，所需的半抗原方向和与载体的距离，以及偶联对生物学和抗原特性的可能影响。例如，蛋白质和肽含有可靶向偶联的伯胺（赖氨酸残基的 N 端和侧链），羧基基团（C 端或天冬氨酸和谷氨酸的侧链）和巯基（半胱氨酸残基的侧链）。通常，载体蛋白中的许多伯胺通过交联试剂与半抗原偶联。

EDC 偶联（羧基和胺基交联）

由于大多数蛋白均含有暴露的赖氨酸和羧基，因此采用碳化二亚胺交联剂 EDC 形成免疫原通常是蛋白质 - 载体和肽 - 载体偶联的最简单有效的方法。EDC 与蛋白质载体或肽半抗原上的可用羧基反应，形成活性 O-acylisourea 中间体。随后，这种中间体与伯胺反应形成酰胺键和可溶性尿素副产物。这种高效反应可在不到两小时内产生偶联免疫原。

通常，当涉及多肽抗原和蛋白质载体时，经 EDC 介导的偶联会产生一定量的聚合。这是由于大多数肽和抗原均含有伯胺和羧酸盐（至少分别在 N 端和 C 端）。一些肽会（通过 N 端和 C 端或通过侧链）与自身以及载体蛋白偶联。同样，载体蛋白也会与自身偶联。

这种聚合并不一定是免疫原性或所需抗原特异性抗体产生的不利条件。大分子聚合物可降低偶联物的溶解度，使后续处理和使用更困难。载体表面的一些聚合肽实际上可能会提高肽的免疫原性，从而产生更多的抗体应答。肽将以多种方向偶联，确保分子的所有部分均被呈递且可作为整个细胞群内的抗原。

EDC 介导的肽与载体蛋白偶联。载体蛋白（C）和肽（P）均含有羧基和胺基，因此在两个方向上均会发生偶联。与典型的肽半抗原相比，载体蛋白的体积非常大；因此，每个载体蛋白分子上均存在多个偶联位点。

马来酰亚胺偶联（巯基交联）

采用末端半胱氨酸残基合成的肽含巯基基团，该基团提供了用于与某些交联剂反应的高特异性偶联位点。例如，异型双官能团交联剂 Sulfo-SMCC 含有一个将与游离巯基反应的马来酰亚胺基团以及将与伯胺反应的琥珀酰亚胺（NHS）酯。通过先将试剂与载体蛋白（及其多种胺）反应，然后与含有还原末端半胱氨酸的肽反应，所有肽分子均可采用相同的可预测方向进行偶联。

这是一种两步式反应策略。在分离状态下，通过与过量摩尔 Sulfo-SMCC 进行反应 "活化" 载体蛋白。当 NHS 酯基团被载体蛋白的高丰度氨基取代时， SMCC 中许多分子与载体蛋白结合。随后采用凝胶过滤（脱盐）纯化修饰的载体蛋白，去除过量的交联剂和副产物。在这一阶段，纯化的载体含交联剂所产生的修饰，可使载体表面突出多个活性马来酰亚胺基团。最后，将半胱氨酸封端肽或其他巯基半抗原添加至马来酰亚胺活化载体蛋白中。马来酰亚胺基团与肽巯基（-SH）基团反应形成稳定的硫醚键。

所有蛋白质均可通过这种方式进行马来酰亚胺活化，从而通过还原的硫醇高效偶联半抗原。然而，KLH、BSA 和其他常用的载体蛋白提供预活化形式和便捷试剂盒，可直接与巯基肽进行偶联。购买质量经检测、稳定的马来酰亚胺活化载体蛋白可确保性能一致并节省时间。

马来酰亚胺活化以及载体肽与 Sulfo-SMCC 交联剂偶联。每个载体蛋白分子含大量（数十至数百）伯胺。因此，每个载体蛋白分子均接受多次马来酰亚胺活化，并可与多个肽半抗原偶联。

戊二醛偶联（胺 - 胺交联）

戊二醛可通过相应多肽上的胺交联肽和载体蛋白。这种方法随机靶向赖氨酸残基或肽 N 端和载体蛋白表面赖氨酸 。根据肽氨基酸组成（即它是否含一个以上伯胺），可变抗原呈递（方向）和高上样（聚合）的机会不如 EDC 偶联。然而，如果不要求高特异性和可预测性，戊二醛是一种高效交联剂，并且仍常用于抗体生产设施。

胺 - 胺交联也可通过双琥珀酰亚胺辛二酸酯（DSS）等交联剂及其水溶性类似物 BS3 实现。如果需要更长的间隔臂，还可提供聚乙二醇化 BS3。

了解更多信息：交联剂化学特性

佐剂

为了增强对免疫原的免疫应答，可以使用多种称为佐剂的添加剂。当与免疫原混合并进行注射时，佐剂将会增强免疫应答。佐剂并非载体蛋白的替代品，因为它虽然增强了对免疫原的免疫应答，但无法使半抗原具有免疫原性。佐剂是免疫应答的非特异性刺激物，有助于注射物的沉淀或分离并可显著增加抗体应答。

有多种常用佐剂，包括完全 弗氏佐剂 （CFA 或 FCA）。该试剂由油包水乳剂和灭活的 分支杆菌组成。油水乳液长时间定位抗原， 分支杆菌 将巨噬细胞和其他合适的细胞吸引至注射部位。完全弗氏佐剂用于第一次注射（免疫）。后续增强使用缺乏 分枝杆菌的不完全弗氏佐剂乳液（IFA 或 FIA）中的免疫原。弗氏佐剂非常有效，但因含有毒的分支杆菌成分，会给动物和研究人员带来风险。

氢氧化铝溶液（明矾）是弗氏佐剂的便捷替代品。明矾比弗氏佐剂更容易与免疫原混合，因为它不需要费力的乳化。它不是如完全弗氏佐剂（CFA 或 FCA）的强刺激剂，因为它对完全非免疫原性化合物产生免疫应答的可能性较小。然而，绝大多数的肽 - 载体蛋白偶联物均具有免疫原性，且明矾对其有显著的刺激。使用明矾比弗氏佐剂更安全，因为它不太可能导致注射部位组织坏死。

免疫方案 

在与佐剂混合前的免疫原浓度将最终决定每次注射将给药的偶联物量。已证实以下方案可成功用于注射和放血。为方便您或动物的状况需要这样考虑时，可定制时间表。在任何情况下，如果在动物身上观察到严重反应，无论是局部还是全身反应，均应停止注射。这些动物操作程序仅限经认证的合格人员执行。不熟悉这些技术的人员应在尝试对动物进行免疫和放血之前咨询有经验的研究人员进行培训。

小鼠免疫时间表：

• 第0天：从小鼠中采集免疫前血清，在免疫后进行 ELISA 筛选时用作空白对照。冷冻条件下存放。每只小鼠注射 50 至 100µg 免疫原（相当于 100 至 200µL 抗原 - 佐剂混合物）。典型注射途径包括腹膜内（i.p.）或皮下（s.c.）注射。每只动物可进行一次或两次此类注射。
• 第14天：使用等量的佐剂中免疫原进行增强。
• 第21天：通过 ELISA 检测出血和抗体应答。（麻醉小鼠通常经尾静脉或眼窝后丛采血）。
• 第28天：如有必要，再次进行增强。继续执行类似的交替增强和放血测试时间表，直至观察到满意的应答。为产生单克隆抗体，在与溶解在盐水（不含佐剂）中的免疫原融合前 4 至 5 天经 i.p. 或静脉注射（i.v.）。

兔免疫时间表：

• 第0天：从兔中采集免疫前血清，在免疫后进行 ELISA 时用作空白对照。冷冻条件下存放。将 100µg 免疫原（相当于约 200µL 抗原佐剂混合物）注射至兔背部 8 至 10 个皮下位点的每一个位点中。也可采用其他注射途径进行注射，但这种方法是目前最容易的兔注射方法。
• 第14天：使用等量的佐剂进行增强。
• 第21天：通过 ELISA 检测出血和抗体应答。（兔通常经耳静脉采血，无需麻醉）。采集 5 至 10 mL 血液并不难，这些血液足以测量抗体应答。
• 第28天：如有必要，再次进行增强。继续执行类似的交替增强和放血测试时间表，直至观察到满意的应答。

抗体筛选 

在任何定制抗体生产项目中，抗体筛选、滴定和分型均为重要的过程中和最终抗体测试步骤。这些测试提供了决定选择和继续使用哪些免疫动物或细胞系，应在特定应用中使用哪些稀释液和二级试剂以及如何有效纯化抗体所需的信息。

抗体纯化 

血清或腹水总 IgG 组分的一般纯化通常采用蛋白 A、蛋白 G 或其他此类亲和树脂来完成。虽然半抗原特异性抗体可能仅占总数的 2% 至 5%，但对于许多应用而言，一般 IgG 纯化已足够。如果其他免疫球蛋白组分不会产生脱靶结合和背景，则它们的存在并不是问题。

一些检测系统和特定实验需要对半抗原特异性抗体进行纯化。这可以通过将原始半抗原固定在固相支持物上实现，固相支持物不含用于制备免疫原的相同载体蛋白。为此，提供了多种活性亲和树脂。

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