无细胞蛋白表达

体外 蛋白表达 (也称为 体外 翻译、无细胞蛋白表达、无细胞翻译、或无细胞蛋白合成) 是一种能使研究人员快速表达和生产少量功能蛋白的技术。与基于细菌或组织培养细胞的 体内  技术相比， 体外 蛋白表达要快得多，因为它不需要基因转染、细胞培养或大量蛋白纯化。

尽管 体外 表达不适用于商业化大规模重组蛋白生产，但它具有多种特性，使其在许多研究应用中更有用和灵活。

• 表征蛋白间相互作用和蛋白核酸间相互作用的实验
• 功能分析用突变或截短蛋白的快速、高通量表达
• 带有适当糖基化和天然翻译后修饰 (PTM) 的哺乳动物蛋白表达
• 用稳定同位素标记蛋白用于结构分析
• 功能性病毒或有毒多肽的生产
• 蛋白质折叠、蛋白质稳定性或蛋白质降解所需组分分析

该图提供了将无细胞蛋白表达方法与蛋白质谱分析 (MS) 结合使用的示例。

重重组蛋白表达\纯化和质谱分析的工作流程。细胞裂解物与反应混合物、载体 DNA 和重或轻稳定同位素标记氨基酸结合，以表达重组蛋白。然后，表达的蛋白经纯化并将其酶切为肽，用于 LC-MS 分析。该方法可对稳定同位素标记的蛋白进行定量。

既成事实  的核蛋白表达需要两个基本组成部分：(1) 编码靶蛋白的基因模板 (mRNA 或 DNA) 和 (2) 含有必要转录和翻译分子机制的反应溶液。 细胞提取物提供反应溶液的所有或大多数分子，包括：

• 用于 mRNA 转录的 RNA 聚合酶
• 用于多肽翻译的核糖体
• tRNA 和氨基酸
• 酶辅因子和能量源
• 用于正确折叠蛋白的必要的细胞组分

细胞裂解物提供正确的翻译所需酶组成和比例以及构件。(通常，还必须添加能量来源和氨基酸以维持合成。)去除细胞膜仅留下细胞的细胞溶质和细胞器组分 (因此，"无细胞提取物")。为无细胞蛋白表达开发的第一类裂解物源自原核微生物。最近，已开发并上市了基于昆虫细胞、哺乳动物细胞和人细胞提取物的系统。

用于无细胞蛋白表达的提取物由已知支持高水平蛋白合成的系统制成。第一类能够支持翻译的已知无细胞提取物由 大肠杆菌制成。该领域的进展导致  从兔网织红细胞裂解物 (RRL) 、小麦胚芽提取物和昆虫细胞 (如 Sf9 或 SF21) 裂解物开发了整套真核生物体翻译系统。由这些真核系统制成的提取物含有高效蛋白合成所需的所有必要的细胞大分子 (如核糖体，翻译因子和 tRNA) (必须补充能量源和氨基酸)。

来自 大肠杆菌 的裂解物中没有内源性遗传信息。相比之下，由兔网织红细胞和昆虫细胞制成的裂解物含有可在合成反应期间翻译的内源性 mRNA。这些裂解物使用微球菌核酸酶进行预处理，以仅支持外源性提供的信息的翻译。一旦去除内源性基因和转录本，添加 RNase 抑制剂，防止 mRNA 进一步降解。

下表比较了无细胞蛋白表达系统，重点介绍了现有提取物系统用于人重组蛋白合成的优点和缺点。选择无细胞表达系统应考虑蛋白，应用和用于蛋白表达的模板的生物学性质。

虽然基于 大肠杆菌、RRL 和小麦胚芽提取物的无细胞系统比传统 体内 蛋白表达具有一些优势，但其在生产通过翻译后修饰 (PTM)完成的人蛋白的能力方面仍有限。 大肠 杆菌和小麦胚芽提取物的无细胞系统无法进行蛋白糖基化。采用兔网织红细胞系统时，必须将犬微粒体膜添加到翻译混合物中以产生糖基化蛋白，但降低总体蛋白得率。昆虫无细胞系统的糖基化蛋白产量高于 RRL 系统，但获得的糖基化模式与人细胞产生的糖基化模式不同。

我们的研究人员基于人细胞系的提取物优化了无细胞表达系统。(当前的商业化系统采用 HeLa 细胞裂解物，尽管其他细胞系已用于优化各种特定结果。)该策略可使用能够提供正确翻译后修饰的裂解物，蛋白质产量高于其他哺乳动物无细胞系统的裂解物。下面的示例说明了使用市售试剂盒来实现糖蛋白无细胞表达。

糖基化无细胞蛋白表达。使用 Thermo Scientific 一步法人偶联 IVT 试剂盒 - DNA 表达的 pT7CFE-CHA 载体，可克隆到三种不同的糖蛋白，并且可以使用或不使用糖苷内切酶 H (Endo H) 处理。使用抗 HA 抗体进行 Western 印迹。由 Endo H 从糖基化蛋白 (三角形) 中去除 N 键合糖，从而留下未糖基化蛋白 (最低条带)。

无细胞表达系统可支持从 DNA 模板 (转录和翻译) 或 mRNA 模板 (仅翻译) 进行蛋白合成。原则上，无细胞表达系统可设计为作为两个单独连续反应 (键合) 或同时作为一个反应 (偶联) 完成转录和翻译步骤。

Thermo Scientific 1 步法人 体外 翻译 (IVT) 试剂盒使用偶联规格并针对 DNA 模板中的蛋白表达进行了优化。然而，可提供使用这些相同 mRNA 试剂 (仅限翻译) 的方案。

一步法人偶联 IVT 试剂盒的方案总结。只需将 °适当模板加入 HeLa 细胞裂解物、辅助蛋白 和反应混合物中，混合并在 30 ℃ 下孵育 90 分钟，蛋白产量高达 100 μg/mL。较小的反应很适微孔板形式的突变变体表达。反应体积和时间可以增加，以表达更大量的单一蛋白，供用于多种下游应用。

 体外 转录的模板 DNA 可以是线性的、环状质粒或 PCR 片段。然而， DNA 必须包含待转录基因上游的启动子序列。DNA 依赖的 RNA 聚合酶 (RNA Pols) 使用特异性 DNA 序列或元件来识别并结合基因中的启动子区域来启动转录。某些 RNA Pols 只有一个亚基 (例如来自 T3 和 T7 以及线粒体等细菌噬菌体)，而来自细菌和真核生物的其他 RNA Pol 是需要额外蛋白因子来实现高效转录的多亚基酶。多聚酶难以从纯化的亚基进行重构。相比之下，噬菌体来源的较小单体 RNA pols 可以进行转录，包括从 DNA 模板终止并释放转录本，而无需额外的蛋白因子。这些特征使噬菌体 RNA pols 成为 体外 转录反应的极佳工具。

有三种不同的市售 DNA 序列特异性的噬菌体 RNA pols 可用于 体外 转录：

• T7 RNA polymerase
  (启动子序列：TAATACGACTCACTATAGGG)
• T3 RNA 聚合酶
  (启动子序列：AATTAACCCTCACTAAAGGG)
• SP6 RNA 聚合酶
  (启动子序列：AATTTAGGTGACACTATGAA)

已有市售克隆载，含针对特定噬菌体 RNA 聚合酶的启动子序列。这些克隆载体包含启动子序列下游的多个克隆位点，可插入目的基因并用作 体外 转录的模板。或者，可以在 PCR 生成的 DNA 模板上进行转录，此引物使用含有启动子序列的基因特异性引物 (上游 (或正向) 基因特异性引物的 5' 端)。

为了生成成熟 mRNA 的转录本进行翻译，需要具有额外功能。原核系统需要”计算机-达利德尔”序列来协助正确翻译。真核系统需要进行 mRNA 预处理才能构建成熟的 mRNA。这包括：

• 在信息的 5’端添加“Cap”结构和/或在真核无细胞翻译系统的翻译起始点上游添加 IRES 元件
• 在起始密码子上游添加 Kozak 序列，以辅助翻译正确的读码框
• 在翻译终止密码子下游的 3' 端添加一个聚腺嘌呤序列
• 剪接以去除 mRNA 内含子，仅留下编码靶蛋白的外显子

在活细胞中，这些修饰发生在转录后，在 mRNA 从细胞核导出到细胞质以进行翻译之前是必需的。尽管真核 mRNA 预处理的复杂性，这些改变显著提高了 mRNA 的稳定性、翻译效率和准确度。

关于 体外 表达，这些序列元件可掺入起始 DNA 载体中，以便转录的立即产物相当于成熟 mRNA。为了协助克隆整合适当序列的基因，含有针对原核或真核细胞无细胞表达系统转录和翻译优化的元件的载体已经上市销售。用于 HeLa 和 CHO 无细胞表达系统的 T7 载体汇总于下表。

与上述转录机制相比，翻译机制涉及太多复杂组分而不能作为纯化分子单独提供。全细胞提取物提供唯一实用方法，供应所需的翻译装置，以便 体外"读取"成熟 mRNA 信息并生成肽。对于执行翻译后修饰所需的酶和因子也是如此。

然而，以细胞提取物形式提供大多数必要组分并不消除使用选定的添加剂补充翻译反应混合物的机会或价值。实际上，为了提高蛋白得率，通常会给提取物补充氨基酸和能量源以促进蛋白表达。当条件优化时，可在约一小时内以合成适量的功能蛋白，用于多种下游应用。反应混合物外部所需的唯一要求是培养箱以维持最佳酶活性。

根据系统的不同，可以进一步处理已翻译的蛋白质，使蛋白质状态与 体内类似。这包括正确的蛋白折叠、氨基酸处理和其他调节蛋白生物学的翻译后修饰。通常，从较低生物体 (如细菌) 衍生的系统几乎没有蛋白处理，这一点可通过重新出现的蛋白不溶解度和包涵体形成问题而明显看出。以下代表性数据提供了细菌 体外 表达系统的一个示例，该系统旨在从 大肠杆菌 细胞裂解物中获得高产量的全长功能蛋白。

高产量无细胞蛋白表达。使用 Invitrogen Expressway Maxi 无细胞 大肠杆菌 表达系统、pEXP5-NT/TOPO 和 pEXP5-CT/TOPO 载体在 2 mL 反应 (1 mL 初始反应 和 1 mL 补料缓冲液) 在 6 小时内表达 6 种不同蛋白。通过 ³⁵S-蛋氨酸标记确定表达水平。使用该试剂盒可利用独特配方的补料缓冲液生产毫克级的蛋白。

1. Imataka H, Mikami S (2009) Advantages of human cell-derived cell-free protein synthesis systems.Seikagaku 81(4):303–7.
2. Mikami S et al.(2008) A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.Protein Expr Purif 62(2):190–8.
3. Kobayashi T et al.(2007) An improved cell-free system for picornavirus synthesis.J Virol Methods 142(1-2):182–8.
4. Mikami S et al.(2006) A hybridoma-based in vitro translation system that efficiently synthesizes glycoproteins.J Biotechnol 127(1):65–78.
5. Mikami S et al.(2006) An efficient mammalian cell-free translation system supplemented with translation factors.Protein Expr Purif 46(2):348–57.