化学发光免疫印迹检测

与其他检测方法相比，免疫印迹化学发光检测法具有多种优势，因此很受欢迎。使用化学发光可进行多次曝光，从而优化信噪比。可以去除检测试剂并重新处理整个印迹，以观察另一种蛋白质或优化第一种蛋白质的检测。线性反应范围宽，可检测和定量宽范围的蛋白质浓度。最重要的是，化学发光法在现行所有免疫印迹检测方法中具有最高的检测灵敏度。这些优势使化学发光成为大多数蛋白质实验室的首选检测方法。

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本页内容

• 化学发光免疫印迹检测方法
• 技术考虑因素
• 数据捕获
• 蛋白分子量标准

免疫印迹是一种功能强大的技术，可间接检测固定在硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上的蛋白样品。在常规免疫印迹中，首先通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离蛋白样品，然后电泳转移到膜上。经过封闭步骤之后，使用针对相关抗原提出的一抗进行探针检测。在后续漂洗步骤后，将膜与对一抗有反应的偶联二抗进行孵育。偶联二抗的两种最常见酶是辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP)。这些酶催化化学反应以产生可捕捉的光学信号。

HRP 和 AP 的化学发光底物与其他底物的不同之处在于，检测到的光信号是反应的瞬时产物，仅在酶 - 底物反应发生时存在。这与产生稳定有色产物的显色底物不同；这些有色沉淀物在酶-底物反应结束后仍留在膜上。在化学发光免疫印迹中，底物是反应中的限制因素；当底物耗尽时，光信号的产生会减少，最终停止。抗体稀释度经过优化的实验体系可在数小时内产生稳定的光输出，实现持续且灵敏的蛋白检测。

化学发光免疫印迹底物的选择由所用酶催化物决定。具体而言，基于鲁米诺和吖啶的试剂是化学发光 HRP 底物。对于 AP 的化学发光检测，可使用含吖啶和 1,2-二氧环乙烷的底物。

辣根过氧化物酶 (HRP) 催化底物经过氧化氢氧化，产生有色或荧光产物，并释放光作为反应的副产物。HRP 在近中性 pH 值下具有最佳功能，但会受到氰化物、硫化物和叠氮化物的抑制。抗体-HRP 偶联物在酶和抗体的特异性活性方面均优于抗体-AP 偶联物。此外，HRP 的转化率高、稳定性好、成本低、底物来源广泛，使其成为大多数应用的首选酶。由于 HRP 酶的体积相对较小，因此使用聚-HRP 偶联二抗可进一步提高灵敏度，可能无需为某些研究人员使用 ABC 型扩增系统。碱性磷酸酶 (AP) 催化底物分子中磷酸基团的水解，产生有色或荧光产物，并释放光作为反应的副产物。AP 在碱性 pH 值（pH 值为 8–10）下具有最佳的酶活性，并可被氰化物、砷酸盐、无机磷酸盐和二价阳离子螯合物（如 EDTA）抑制。作为免疫印迹标记物，AP 与其他酶相比具有明显优势。由于其反应速率保持线性，只需让反应进行更长时间就可以提高检测灵敏度。

由于 HRP 是免疫印迹中最常用的酶，因此在本文中将作为我们的示例进行讨论。提供多种 Thermo Scientific Pierce ECL 和 SuperSignal 化学发光 HRP 底物，可为化学发光免疫印迹提供不同水平的灵敏度。请参阅表 1，根据您感兴趣的目标蛋白的丰度、含有目标蛋白的样品丰度、灵敏度水平和可用于检测的仪器类型，确定最合适的 HRP 化学发光底物。该表还概述了常用的增强型化学发光 (ECL) 和 SuperSignal 化学发光底物的特性。

HRP 的化学发光底物通常是双组分系统，包括稳定的过氧化物溶液和增强的底物溶液，通常以鲁米诺为基础。在大多数情况下，要配制工作溶液，需要将等体积的两种成分混合在一起。当与结合了 HRP 偶联抗体（或其他探针）的印迹孵育时，化学反应会发出 425 纳米波长的光，X 射线胶片和 CCD 相机成像设备可以捕捉到这些光，从而检测化学发光。虽然 X 射线胶片可提供定性和半定量数据，并有助于确认目标蛋白的存在，但与胶片相比，基于冷却 CCD 相机的成像仪具有定量分析、快速数据捕获、灵敏度更高、分辨率更高以及动态范围更大等优势。

表 1.Thermo Scientific 化学发光 HRP 底物。

化学发光鲁米诺反应过程中产生的光输出相对较短；因此，已开发增强型化学发光 (ECL) 底物。例如，使用具有鲁米诺的增强剂可提高信号灵敏度、强度和酶底物反应的持续时间。Pierce ECL 底物适用于进行高丰度蛋白探测或优化实验的免疫印迹应用。不过，高灵敏度蛋白质检测底物已经研制成功。例如，SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物可通过免疫印迹分析进行皮克级至高飞克级的蛋白检测。

了解更多信息：在蛋白印迹中检测低丰度蛋白质
立即查看：化学发光底物选择指南

抗体稀释度

免疫印迹优化最有效的手段之一是优化抗体稀释度。许多因素可能会影响所需抗体稀释度，包括抗体体积、抗原抗体特异性、蛋白丰度以及底物的选择。此外，单独的实验室操作指南可能会指导研究人员选择之前优化的首选条件。优化抗体是确保适当信噪比的关键步骤。一抗是特异性针对靶抗原的，可与蛋白质上可用的表位位点结合。经过一系列用于去除未结合一抗的漂洗步骤后，孵育与 HRP 等酶偶联的二抗，并与一抗结合。多个二抗可与单个一抗结合，通过使更多产生光信号的标记物发生反应实现信号扩增，产生更高的可检测信号。一抗或二抗过多会导致印迹过饱和或背景信号过高。此外，过多的抗体会导致信号迅速形成，然后迅速衰减--在胶片或成像系统捕捉到信号之前，信号就有可能迅速消失。这些问题使得正确分析实验并从中得出结论变得极为困难。下表基于蛋白质标靶或样品丰度、抗体条件和底物选择，为您提供抗体稀释的通用指导。还请务必注意，当从一种底物转换为另一种底物时，可能需要根据供应商的建议重新优化其抗体稀释度。

抗体稀释度计算器

抗体稀释度建议

信号捕获

免疫印迹是一种功能强大的常规应用；然而，捕获化学发光信号有时会具有挑战性，因为免疫印迹包括一系列需要特定技能才能高质量完成的步骤。信号捕捉失败可能是由许多因素造成。由于变量太多（表 2），对不理想结果进行原因排查无异于“大海捞针”。传统方法通常无法有效检测特定蛋白。因此，通常需要常见问题指南来帮助优化结果。有关影响免疫印迹结果的因素概述，请查看表 2。要获取免疫印迹常见问题指南，请访问免疫印迹 - 常见问题排查。

表 2.影响免疫印迹结果的因素。

信号强度和持续时间

在理想的免疫印迹条件下，化学发光信号可持续 6-24 小时光信号生成的水平和持续时间取决于所使用的特定底物和系统中的酶 - 底物比例。虽然印迹上的底物数量相对恒定，但存在的酶量取决于添加的量和其他因素（表 2）。在免疫印迹系统中使用过多的酶偶联物是造成信号变化快、背景黑、信号持续时间短和灵敏度低的最大原因之一。理想的信号发射曲线是缓慢衰变的（参见下图），因为这表明系统的每个组分都经过优化，并可获得高重复性的结果。迅速衰减的信号可能会导致结果差异性高、低灵敏度、高背景以及无法及时捕获图像。持久的信号则可尽可能降低因转印效率、不同生产批次的底物和其他因素导致的结果差异。HRP 分子与底物中的鲁米诺的氧化反应，除了产生的光信号外，还产生自由基。体系中的大量 HRP 会产生大量自由基，从而加快 HRP 灭活的概率。自由基也可能损伤抗原、抗体和膜，从而降低重新检测的效果。下图举例说明了使用短持续时间和长持续时间底物生成的信号发射曲线。

直接方法和间接方法

直接检测使用标记的一抗。由于省去了与二抗的孵育过程，这种策略比经典的免疫印迹所需时间更短。此外，还可避免与二抗交叉反应产生的背景信号。直接检测还支持同时检测多个标靶。然而，标记一抗有时会影响其免疫反应性，并且无法进行信号放大。由于直接检测法的灵敏度通常低于间接检测法，因此在标靶丰度相对较高时更为适合。一种选择是对一抗进行生物素化，这是一种间接方法，既能放大信号，又无需使用二抗。使用生物素化试剂进行标记后，每个抗体分子通常会产生一个以上的生物素分子。每个生物素分子都能够与酶偶联的亲和素、链霉素亲和素或 Thermo Scientific NeutrAvidin 蛋白（货号 31000）相互作用。本质上，生物素结合偶联物取代了二抗，其适当的摩尔浓度与使用二抗相同。生物素化试剂（通常小于 2 kDa）与酶（HRP 为 40 kDa；AP 为 140 kDa）相比体积小，通常可减少空间位阻，使标记的一抗发挥更大的功能。

在涉及使用特异性抗体进行检测的测定（例如免疫检测）中，通过亲和素 - 生物素复合物形成进行直接和间接蛋白检测并放大信号。

Far-Western Blot远免疫印迹方法

偶尔，特定抗原的抗体不可获取，或不适合进行免疫印迹分析。如果相应的结合配偶体可作为探针使用，则可通过印迹法进行靶蛋白特异性检测。这种类型的应用被称为Far-Western Blot，通常用于发现或确认蛋白质间相互作用。免疫印迹检测的方法有很多种，包括但不限于前面提到的策略。在Far-Western Blot中，可以使用 35S 标记的探针进行体外翻译反应标记结合配偶体。也可以对探针进行生物素化并使用生物素结合蛋白偶联物进行检测。这种类型的检测还具有信号放大的优势。但是，使用这种技术时，探针不应过度标记，以防标靶检测受到影响。此外，还可以在细菌中表达带有 GST、HA、c-Myc 或 FLAG 等标签的重组探针，通过特定标签的标记抗体进行检测。与其他印迹技术一样，Far-Western Blot对膜检测系统和凝胶内检测系统均有效。下图概述了Far-Western Blot工作流程。

分析蛋白质间相互作用的Far-Western Blot图。在本示例中，使用标签诱饵蛋白检测转印膜或凝胶中的猎物蛋白。结合后，使用靶向诱饵标签的酶（辣根过氧化物酶；HRP）偶联抗体标记相互作用，然后通过酶促化学发光检测。如下表所示，可采用通过抗体检测到的未标记诱饵蛋白，由酶偶联链霉素亲和素检测到的生物素化诱饵蛋白或通过暴露于膜下检测的放射性标记诱饵蛋白检测这种一般方法进行调整。

了解更多信息：Far-Western Blot分析
立即查看：远免疫印迹试剂盒

化学发光免疫印迹信号可通过 X 光胶片、电荷耦合器件 (CCD) 相机的数字成像仪器以及检测化学发光的磷光成像仪进行捕获。虽然 X 光胶片可提供定性和半定量数据，并有助于确认目标蛋白质的存在，但与胶片相比，基于 CCD 相机的成像仪器具有定性分析、即时图像捕捉和分析、灵敏度更高、分辨率更高以及动态范围更大等优势。此外，不需要专用的暗室空间和显影设备。成像仪器可直接放置于工作台上，与其他实验室设备放在一起。

用于捕捉化学发光图像的 CCD 相机

优点	限制
具有 >4 个数量级的动态范围	长时间曝光（>60 分钟）会导致相机噪声背景增加
智能算法有助于确定最佳曝光时间
简化图像分析和存储
即时显示结果
定量
iBright 成像系统采用 910 MP 冷 CCD 相机，具有高灵敏度和动态范围，有助于检测样品中的细微差别。

通常，有必要在不同的时间周期中曝光多张膜，以获得信号和背景之间的适当平衡。我们的目标是把握膜在胶片上的曝光时间，使所需信号清晰可见，而背景保持在较低水平。要做到这一点非常困难，因为无法对过程进行观测，也无法在达到预期终点时停止观测。如果胶片曝光时间不够（曝光不足），信号将不可见。如果胶片曝光时间过长（曝光过度），信号可能会在背景中丢失，或者单独的条带可能会变得模糊不清。此外，判断最佳曝光时间非常主观，因为很难直观地确定达到信噪比最佳平衡的精确点。经常对胶片曝光和显影进行重复的曝光，这会增加大量的时间投入。在胶片上捕获数据后，通常扫描胶片以制作数据的数字拷贝，然后将其导出至分析软件以促进进一步分析，如光密度测定和分子量估算。

数字成像系统的最大优点之一是能够微调曝光时间（有些系统能够将曝光时间调整到千分之一秒）。此外，许多系统还提供特定的自动曝光设置，该设置采用自动确定最佳曝光时间的算法，不仅能够以最佳信噪比捕获图像，而且与胶片通常需要的多次曝光相比，还能节省大量时间。由于数据是以数字方式采集的，因此可以轻松导出到分析软件中（省去了胶片的扫描步骤）。一些最先进的系统能够直接在仪器上进行分析。这些便利使数字成像成为基于薄膜的数据捕获的热门替代产品。

了解更多信息：X 光胶片与数字成像仪器
立即查看：免疫印迹成像系统

对于任何免疫印迹的检测，最好使用预染蛋白分子量标准，这些分子量标准与蛋白样品一起转印到膜上。膜上蛋白分子量标准的条带，可用于估算蛋白条带的分子量，以及在转印步骤前在凝胶中有效分离目标蛋白。当化学发光检测用于免疫印迹时，在膜上或数字成像设备上检测蛋白条带。除非经过修饰，蛋白分子量标准不会在膜上显示，因为它们不会产生光信号。为此，下面介绍了几种解决方案。

一种解决方案是使用采用蛋白 A 或 G 的抗体结合结构域的分子量标记物。这些蛋白的抗体捕获结构域被设计成分子量标记物，从而与免疫印迹中使用的抗体结合，从而产生信号并与实验数据一起捕获。由于抗体对蛋白 A 和蛋白 G 的亲和力不同，导致信号水平不同，因此这些标记物的应用受到限制。许多抗体，例如小鼠 IgG1 亚类抗体，与蛋白 A 或 G 的结合力不强。另一种常用的方法是使用生物素化的蛋白分子量标记物，这些标记物可与检测抗体一起使用链霉素亲和素，或者使用生物素化的一抗。

立即查看：免疫印迹蛋白分子量标准

1. G.H.Thorpe, L.J.Kricka.(1986) Enhanced chemiluminescent reactions catalyzed by horseradish peroxidase.Methods in Enzymology 133:331–54.
2. Alegria-Schaffer, A., et al.(2009) Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection.Methods Enzymol 463:573–99.
3. Gassmann, M., Granacher, B., Rohde, B. and Vogel, J. (2009) Quantifying Western blots:Pitfalls of densitometry.Electrophoresis 30:1845–55.

• 手册： 蛋白凝胶电泳技术手册
• 手册： Western Blotting 技术手册
• 手册： 蛋白质研究
• 技术指南：化学发光免疫印迹技术指南和实验方法