蛋白定量测定化学原理

根据所涉及的化学原理类型，大多数比色蛋白定量测定方法可分为两组：一组涉及蛋白-铜螯并利用二次检测还原铜，另一组基于蛋白质-染料结合并直接检测与结合染料相关的颜色变化。

大多数市售蛋白定量测定试剂是特性良好的可靠产品，可提供一致、可靠的结果。然而，每种检测试剂都有其局限性；对每种类型的检测所涉及的化学物质有基本的了解，对于为给定样品选择合适的方法和正确评估结果至关重要。

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肽与双缩脲反应

基于铜的蛋白定量测定，包括 BCA 和 Lowry 法，依赖于众所周知的"双缩脲反应"，其中含有三个或更多个氨基酸残基的肽在含有酒石酸钠钾的碱性环境中与铜离子（Cu2+）形成有色螯合物。这被称为双缩脲反应，因为它在化学上与有机化合物双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）和铜离子形成的络合物类似。双缩脲是过量尿素和热量的产物，其与铜反应形成浅蓝色的四配位络合物。

单个氨基酸和二肽不发生双缩脲反应，但三肽及更大的多肽或蛋白会发生反应，产生吸收 540 nm 光的浅蓝色至紫色复合物。一个二价铜离子与附近四到六个肽键形成有色配合物。生成的颜色强度与参与反应的肽键数目成正比。因此，双缩脲反应是用于定量测定总蛋白浓度的简单而快速的同名比色试剂的基础。双缩脲定量测定的工作范围为5-160 mg/mL，这足以满足某些类型的工业应用，但对于大多数蛋白研究需求则灵敏度不够高。

BCA 蛋白定量测定由 Smith 等人 于1985年发明。从那时起，该方法已成为比色检测和定量总蛋白的最流行的方法。与当时可用的其他方法（如 Bradford 和 Lowry 定量测定）不同，BCA 蛋白定量测定具有一个特别的优点，其能对含有高达5%表面活性剂（去污剂）的样品进行测定。此外，与 Bradford 定量测定相比，BCA 定量测定对不同蛋白的响应更一致。

BCA 蛋白定量测定将蛋白诱导的双缩脲反应（见上文）与具有高度灵敏度与选择性的比色检测相结合，利用二辛可宁酸（BCA）测定产生的亚铜阳离子（Cu1+）。因此，涉及两个步骤。首先是双缩脲反应，其淡蓝色是铜离子还原为亚铜离子而产生。其次是 BCA 与亚铜离子螯合，产生深紫色。紫色反应产物由两个 BCA 分子与一个亚铜离子螯合形成的。BCA/铜复合物为水溶性，且随着蛋白浓度增加，在562 nm 处表现出强线性吸收。可在550 nm 和570 nm 之间的任何波长下测量紫色，信号损失最小（小于10%）。BCA 试剂的灵敏度（检测下限）约为双缩脲试剂的100倍。

Cu2+ 还原导致 BCA 颜色形成的反应尤其受到蛋白中三个特定氨基酸残基（半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）存在的影响。显然，这些氨基酸在双缩脲反应中独立地增强铜还原，从而导致形成有色的 BCA-Cu1+ 螯合物。然而，用二肽和三肽进行的研究表明，其产生的颜色比四种单独 BCA 反应性氨基酸产生的颜色更多。换言之，肽骨架（以及蛋白总量）是双缩脲反应中铜还原和 BCA 测定中显色的主要贡献者。在进行 BCA 蛋白定量测定时，不同蛋白间存在微小变异，这是由于各蛋白内部上述三种氨基酸含量不同引起。

BCA 与亚铜离子结合能有效去除双缩脲反应的弱螯合肽。然后，这些肽基团自由结合另一个铜离子分子。因此，如果二辛可宁酸和铜大量过量存在（通常在 BCA 蛋白定量测定试剂中一直过量），则蛋白定量测定不会到达反应终点。此外，BCA 颜色形成率取决于孵育温度。因此，使用 BCA 定量测定方法获得准确结果的关键是同时测定标准品和未知样品，这样他们的孵育时间和温度均相同。假设以这种方式进行测定，测定特性使人们能够根据需要加速显色或等待更长时间以获得所需的显色。

还原铜的物质也会在 BCA 测定中产生颜色，从而干扰蛋白质定量测定的准确性。螯合铜的试剂也通过减少与蛋白质一起产生的 BCA 颜色的量造成干扰。某些单氨基酸（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）也会产生颜色并干扰 BCA 测定。技术要点和 BCA 蛋白定量测定专用产品可以解决此类样品兼容性问题。

比色蛋白定量测定的最新进展是Dilution-Free Pierce Rapid Gold BCA 蛋白定量测定，其保留了传统 BCA 定量测定的高灵敏度和线性，但提供了五倍宽的动态范围（20-10,000 µg/mL），并且在室温（RT）孵育 5 分钟内即可读取结果。

与传统的 BCA 定量测定一样，Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA 蛋白定量测定涉及在碱性介质中通过蛋白还原铜（双缩脲反应），以通过新的铜螯合剂产生灵敏和选择性的比色检测。被还原的铜的量与溶液中存在的蛋白的量成正比。选择性铜螯合剂形成一种橙-金色复合物，在480 nm 处强烈吸收光。该代表性数据比较了常规和新改进的 BCA 蛋白定量测定的性能。

Lowry 蛋白定量测定以 Oliver H. Lowry 命名，他开发并推广了该检测方法（Lowry, et al., 1951）。该方法是对原有蛋白检测方法的显著改进，而他的文章也在很多年内是生命科学领域引用次数最多的文章之一。改良 Lowry 蛋白定量测定使用一种稳定的试剂代替 Lowry 法中两种不稳定的试剂。本质上，该检测方法是一种涉及铜螯合化学的改进双缩脲测定。

尽管 Lowry 定量测定的颜色形成机制与 BCA 蛋白定量测定相似，但两者之间存在几项显著差异。Lowry 定量测定中颜色形成的确切机制仍不明确。该测定分两个不同的步骤。首先，在酒石酸存在下，蛋白与碱性硫酸铜于室温下反应10分钟。在此孵育过程中，由四个肽键和一个铜原子形成四配位铜络合物（这是"双缩脲反应"）。其次，加入磷钼酸-磷钨酸溶液。这种化合物（称为福林-酚试剂）被还原，产生深蓝色。通常认为，当四配位铜络合物将电子转移到磷钼酸 - 磷钨酸络合物时，导致颜色变深。在30分钟室温孵育过程中，蓝色持续加深。研究已经表明，在30分钟孵育过程中，初始不稳定蓝色络合物重排导致具有较高吸光度的稳定最终蓝色络合物（Lowry, et al.1951; Legler, et al.1985）。

最好在750 nm 下测量最终的蓝色，但其可在650 nm 和750 nm 之间的任何波长下测量，颜色强度损失很小。最好在750 nm 下测量颜色，因为很少有其他物质吸收该波长的光。

对于小肽，颜色的量随着肽的大小而增加。如果肽或蛋白骨架中存在五种氨基酸残基（酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺）中的任何一种，则会进一步提高所产生颜色的量，因为其有助于进一步还原磷钼酸/磷钨酸复合物。除酪氨酸和色氨酸外，游离氨基酸不会与 Lowry 试剂形成有色产物；然而大多数二肽均可被检测到。如果肽骨架中不存在上述五种氨基酸中的任何一种，含有脯氨酸残基的蛋白与 Lowry 试剂反应后的颜色较浅，因为这会形成氨基酸干扰复合物。

与 BCA 定量测定不同，Lowry 法中的二次结合步骤不涉及肽-铜螯合物的分离。因此，Lowry 法是一种有效的终点检测方法。虽然对于任何蛋白检测法而言加入内参标准品都是最好的选择，但是使用Lowry法可以根据预制的标准曲线获得合理的蛋白估计值。

该实验方法要求在10分钟孵育结束时将福林酚试剂精确地加入每个试管中。在 Lowry 试剂的碱性 pH 下，福林酚试剂几乎立即失活。因此，最好在准确的时间加入福林酚试剂，同时混匀每个试管。要做到这一点有些难度，因此需要进行一些练习以获得一致的结果。这也限制了在一次实验中可以测定的样品总数。如果每管之间的间隔是10秒，那么10分钟内最多测定60管（10秒/管 x 60管 = 600秒或10分钟）。

Lowry检测试剂在去垢剂或钾离子存在时会形成沉淀。当钾离子是导致沉淀的原因时，有时候可以通过离心去除沉淀并测定上清的颜色。大多数表面活性剂即使在非常低的浓度下也会引起试剂沉淀。但十二烷基硫酸钠（SDS）是例外，其在样品中浓度高达 1% 时仍可与试剂相容。螯合剂通过结合铜并阻止形成铜肽键复合物而产生干扰。还原剂和游离硫醇也通过还原磷钨酸盐 - 磷钼酸盐络合物而干扰检测，一旦加入，立即形成深蓝色产物。

改良 Lowry 蛋白定量测定试剂必须冷藏以长期储存，但使用前必须复温至室温。使用冷改良 Lowry 蛋白定量测定试剂将导致吸光度值降低。

1976 年，Marion Bradford 博士首次提出了使用考马斯 G-250 染料作为检测和定量测定总蛋白的比色试剂（Bradford, 1976）。Thermo Scientific Pierce Bradford 定量测定是 Bradford 首次报告的试剂的变体。

在试剂的酸性环境中，蛋白和考马斯染料结合。这导致光谱移位，从红色/棕色形式染料（在465 nm 处产生最大吸光度）变为蓝色形式染料（在610 nm 处产生最大吸光度）。两种形式染料在595 nm 处差异最大，因此这是测量考马斯染料-蛋白复合物的蓝色的极佳波长。如果需要，可在575 nm 到615 nm 之间的任意波长测量蓝色。与在595 nm 处测得的颜色（吸光度）相比，在波长两端（575 nm 和615 nm）处测得的颜色（吸光度）损失约10%。

Bradford 蛋白定量测定中的颜色形成与蛋白中某些碱性氨基酸（主要是精氨酸、赖氨酸和组氨酸）的存在有关。范德华力和疏水相互作用也参与了蛋白对染料的结合。结合到每个蛋白质分子上的考马斯染料配体的数目大致与蛋白所带正电荷的数量成正比。游离氨基酸、肽和低分子量蛋白不会与考马斯染料试剂产生颜色。通常，肽或蛋白的质量必须至少为3000道尔顿才能采用该试剂进行检测。在某些应用中，这可能是一个优点。例如，考马斯蛋白定量测定已用于测定啤酒酿造业发酵过程中的"高分子量蛋白"。

考马斯染料结合测定是所有蛋白定量测定中最快和最容易进行的。该检测在室温下进行，无需特殊仪器。将标准品和未知样品加入含有预先配制的考马斯检测试剂的试管中，经短时间室温孵育后，在595 nm 处测量产生的蓝色。含考马斯染料的蛋白定量测定与蛋白样品中遇到的大多数盐、溶剂、缓冲液、硫醇、还原物质和金属螯合剂兼容。

考马斯蛋白定量测定的主要缺点在于其与常规用于溶解膜蛋白质浓度下的表面活性剂不兼容。通常，即使在低浓度下，样品中存在表面活性剂也会引起试剂沉淀。此外，考马斯染料试剂具有强酸性，因此不能用该试剂测定酸溶性差的蛋白。最后，考马斯试剂导致的蛋白间变异大约是基于铜螯合的检测试剂的两倍。

即用型液体考马斯染料试剂应在使用前颠倒混匀。这些液体试剂中的染料在未受干扰溶液中可在 60 分钟内形成松散的聚集体。轻轻颠倒试剂瓶混匀试剂可保证染料均匀分布，从而保证分装的试剂均一。与蛋白结合后，染料也形成蛋白质-染料聚集体。幸运的是，这些蛋白-染料聚集体可通过混匀反应管而较容易地进行分散。这种情况适用于所有液体考马斯染料试剂。因为这些聚集体形成较快，所以最好在测量颜色之前对每个测定管或测定板进行常规混匀（涡旋2-3秒）。

2008年推出的 Thermo Scientific Pierce 660 nm 蛋白定量测定是一种基于染料的试剂，可提供与考马斯蛋白定量测定相同的便利性，同时克服了几个缺点。特别地，Pierce 660nm 定量测定与大多数去垢剂相容，且响应曲线更加线性。

该定量测定方法的详细化学原理受专利保护，但基本机制可总结如下。试剂含有可溶于酸性缓冲液得专有染料-金属络合物。染料-金属络合物在酸性条件下与蛋白结合，导致染料的最大吸收发生偏移，可在660 nm 处测得。试剂为红棕色，与蛋白结合后变为绿色。

检测中产生的颜色保持稳定，并能在较宽范围内随着蛋白浓度增大而成比例增加。这种颜色变化是由于染料在低 pH 下去质子化所致，而在带正电荷的氨基酸基团和带负电荷的去质子化染料-金属络合物的蛋白结合相互作用可以促进染料去质子化。

该试剂以类似于考马斯染料的方式与蛋白结合。因此，其具有与考马斯（Bradford）定量测定法相似的蛋白间变异性。然而，与考马斯蛋白定量测定不同，Pierce 660nm 蛋白定量测定与蛋白样品中通常使用的非离子去污剂完全兼容。事实上，与离子型去垢剂兼容试剂（IDCR）一起使用时，Pierce 660nm 定量测定试剂也与含有 Laemmli SDS 样品缓冲液（含溴酚蓝）的样品和其他含有常见离子型去垢剂缓冲液的样品兼容。

基于荧光的蛋白定量测定方法提供了出色的灵敏度，这意味着定量测定仅需更少的蛋白样品，可保留更多样品用于实验。对于下述测定，所需步骤很少，且时间并非关键因素，因为信号持续时间通常为数小时，因此这些测定适用于高通量应用中的自动化处理。可使用荧光计或微孔板酶标仪检测荧光信号。

与比色蛋白定量测定相比，荧光蛋白定量测定通常为研究人员提供更高的灵敏度。Thermo Scientific Quant-IT、Qubit 和 NanoOrange 蛋白定量测定基于染料分子与蛋白上去垢剂包被层和蛋白疏水区域结合，从而产生荧光，而未结合染料无荧光。所有这三种测定的检测波长均为470/570 nm。前两种方法在200 µL 样品中产生0.5-4 µg 准线性标准曲线，样品体积为1-20 µL，而 NanoOrange 的灵敏度范围较低，为10 ng/mL，最高可达10 µg/mL。针对复杂脂质环境中的脂蛋白或蛋白检测，可使用  CBQCA Plus 定量测定试剂盒。这些代表性数据显示了使用荧光法蛋白定量测定试剂盒生成的典型标准曲线。

NanoOrange 蛋白定量测定试剂盒包含一种非常灵敏且简单的蛋白定量测定方法，可检测溶液中低至10 ng/mL 的蛋白。这种荧光染料适用于与荧光分光计和微孔板酶标仪配合使用。针对复杂脂质环境中的脂蛋白或蛋白检测，请查看 CBQCA 蛋白质定量试剂盒。

CBQCA Plus 蛋白质定量试剂盒是一种非常灵敏的溶液中蛋白定量测定方法，能够检测低至10 ng/mL 的蛋白。与我们的 NanoOrange 蛋白定量测定试剂（N-6666）灵敏度类似，CBQCA 更适用于在脂质、膜组分或去污剂存在的情况下对蛋白以及脂蛋白和小分子肽段进行准确定量。该测定的原理是存在氰化物或硫醇时染料与伯胺基团发生反应，从而产生荧光。未反应染料保持无荧光。该蛋白定量测定可检测10 ng/mL 至150 µg/mL 范围内的蛋白。

最后，EZQ 蛋白定量测定试剂盒提供了一种基于荧光的蛋白检测方法，有助于快速定量制备用于凝胶电泳的蛋白样品。该测定基于染料与碱性氨基酸发生静电结合，辅以额外的疏水相互作用，产生可在280 nm 和450/618 nm 处读取的荧光。

荧光计可根据特征激发（Ex）波长和发射（Em）波长测量特异性结合在生物分子上的染料以及天然荧光分子的荧光信号强度的仪器。荧光计设计用于定量测定、检测和监测分析物及其反应，具有高灵敏度和特异性。

Invitrogen Qubit 荧光计是一款能利用高灵敏度的 Qubit 定量检测准确测量 DNA、RNA 和蛋白的台式设备。Qubit 3 荧光计配有优化的算法，采用只在结合目的靶标时才产生信号的荧光染料，从而有助于最大限度地减少污染物（包括降解的 DNA 或 RNA）对实验结果的影响。

1. Bradford, MM.(1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry.72, 248-254.
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