检测蛋白质–RNA 相互作用的方法

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蛋白质通过静电相互作用、氢键合、疏水相互作用和碱基堆叠等方式与 RNA 相互作用，方式类似于蛋白质–DNA 相互作用。蛋白质–RNA 相互作用也受到 RNA 分子三级结构的显著影响。因此，在鉴定蛋白质–RNA 相互作用的检测中，必须正确折叠 RNA 和蛋白质，以实现正确结合。RNA 很容易降解，因此必须特别小心，不要将 RNase 引入反应中。蛋白质–RNA 相互作用是将信使 RNA 分子转运至真核细胞的细胞质中并形成翻译机制所必需的。RNA 翻译速度和稳定性也受蛋白质–RNA 相互作用以及 RNA–RNA 相互作用的影响。本文讨论了蛋白质–RNA 相互作用最常用的研究方法。

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RNA 电泳迁移率实验 (EMSA)

RNA 电泳迁移率实验 (RNA EMSA) 是一种体外技术，用于通过凝胶电泳过程中迁移速度的变化来检测蛋白质–RNA 相互作用。首先，将标记的 RNA 探针与蛋白样品（通常来自细胞裂解物）一起孵育，以启动结合并形成相互作用复合物。然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结合反应。与蛋白质–DNA 复合物一样，蛋白质–RNA 复合物在凝胶基质中迁移速度比游离 RNA 探针慢。这会导致相对于未结合 RNA 探针的迁移偏移。通过竞争反应确定特异性，其中过量未标记 RNA 在结合反应中孵育，如果标记和未标记的 RNA 序列竞争同一蛋白结合，则会导致偏移信号降低。或者，蛋白–RNA 复合物可能需要交联，并在变性凝胶上运行反应。通过单个偏移带的可视化来确定特异性。传统上，RNA 探针采用放射性标记以进行检测，但也以可采用荧光和化学发光检测。非放射性 RNA 末端标记技术有限，但现在可以提供更通用的生物素和荧光标记方法。例如， Thermo Scientific LightShift 化学发光 RNA EMSA 试剂盒为使用 EMSA 研究 RNA-蛋白相互作用提供了一种非放射性解决方案。

优势	限制
可进行非放射性检测易于筛选 RNA 突变体以提高结合效率兼容通过径流标记的 RNA 转录反应，但末端标记的 RNA 探针效果最好	自行设计实验需要显著的试剂优化以取得成功冗长的方案，包括天然电泳步骤确定标识所需的抗体 RNA 结合蛋白需要标记的 RNA 探针设计和合成

使用 Pierce RNA 3' 端生物素化试剂盒生物素化的 RNA 探针进行化学发光 RNA EMSA。生物素化的 RNA 探针保持功能并与 RNA 结合蛋白相互作用。使用 Thermo Scientific Pierce RNA 3' 端生物素化试剂盒试剂盒对铁反应元素 (IRE)、RNA 聚合酶和 Let-7 RNA 探针进行生物素化。使用 LightShift 化学发光 RNA EMSA 试剂盒测试每个生物素化 RNA 探针 (5–10 nM) 与 4-5 µg 细胞提取物在 RNA 结合反应中的功能性，以检测与铁反应蛋白 (IRP)、RNA 聚合酶或 Lin28 的相互作用。泳道 1：游离探针；泳道 2：结合反应；泳道 3：结合反应加上 100 倍过量的未标记探针。每个实验的泳道 2 中存在漂移条带（箭头），其在结合反应中显示出 RNA-蛋白质复合物，通过添加过量未标记的 RNA 探针（泳道 3）来消除这种复合物。

蛋白质相互作用手册

我们的 72 页蛋白相互作用技术手册提供了实验方法、技术和产品信息，有助于最大化蛋白质相互作用研究的结果。该手册为免疫沉淀和免疫共沉淀分析、沉降分析、免疫印迹和交联提供背景、有用提示和故障排除建议。该手册还提供了研究蛋白-核酸相互作用的方法的扩展部分，包括 ChIP、EMSA 和 RNA EMSA。该手册是任何实验室研究蛋白相互作用的重要资源。

内容包括：蛋白质相互作用简介、免疫共沉淀分析、沉降分析、免疫印迹、蛋白质相互作用映射、酵母两杂交报告基因检测、电泳迁移率变动实验 [EMSA]、Chromatin 免疫沉淀检测 (ChIP)、蛋白-核酸偶联物等。

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RNA 沉降实验

RNA 沉降实验可从样品中选择性提取一种蛋白–RNA 复合物。通常，RNA 沉降实验可以利用高亲和力标签，例如生物素 -叠氮化物。RNA 探针可以进行生物素化，与细胞裂解物中的蛋白质复合，然后使用琼脂糖或磁珠进行纯化。或者，可以对蛋白质进行标记，或者可以使用相关靶蛋白的抗体分离 RNA-蛋白复合物。然后通过 Northern 印迹或 RT-PCR 分析检测 RNA，通过免疫印迹或质谱分析检测蛋白质。我们提供 Thermo Scientific Pierce 磁性 RNA-蛋白沉降试剂盒，该试剂盒使用脱硫生物素和链霉素亲和素磁珠对 RNA 进行末端标记，可有效富集 RNA 结合蛋白 (RBP)。 

优势	限制
富集低丰度标靶分离完整复合物兼容免疫印迹和质谱光谱分析	RNA 二级结构对功能非常重要，因此首选末端标记树脂洗脱效率低无核酸酶条件下的微珠/树脂

RNA–蛋白沉降方案。 用脱硫生物素对 RNA 进行末端标记，然后使用 Pierce 磁性 RNA-蛋白沉降试剂盒捕获和富集特定 RNA 结合蛋白的流程图。

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寡核苷酸靶向 RNase H 保护实验

RNA 保护实验 (RPA) 是检测细胞提取物中 RNA 和 RNA 片段的有效方法。不同于 Northern 印迹或 RT-PCR 分析，RPA 实验在标靶 RNA 的完整性中具有更高的灵活性，只需较短的片段即可进行杂交和检测。RPA 实验也可用于分析蛋白– RNA 相互作用。在 RPA 的这种适应性中， RNase H 用于在与 DNA 探针杂交的特定位点切割标靶 RNA 分子。如果蛋白与靶序列上的 RNA 结合，将会阻断探针杂交，防止 RNase H 切割，并表明蛋白和 RNA 之间存在相互作用位点。 RNase H 仅需要与 DNA 探针进行四碱基对杂交，以便切割目标 RNA 分子。使用多个小探针，可实现 RNA 的整个序列映射，以定位相互作用的位点。

优势	限制
可用于体外检测和粗细胞提取物可实现蛋白质与 RNA 相互作用的详细映射可用于功能研究和突变研究	详细映射需要多个探针难以优化罕见的 RNA 分子与高通量分析不兼容

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RPA III 核糖核酸酶保护测定试剂盒

荧光原位杂交共定位

荧光原位杂交 (FISH /ISH) 共定位技术需要使用 RNA 探针和抗体检测 RNA 转录本和目标蛋白。FISH /ISH 可检测细胞或组织样品中 RNA 和蛋白质的位置和丰度。读数是可视化的（通常通过显微镜成像），并且 RNA 和目标蛋白质的共定位信号信号表明可能的复合物形成。必须生成标记的 RNA 探针用于检测 RNA 的特定序列，可使用抗体染色或荧光蛋白构建体检测蛋白质。

优势	限制
提供体内发生的 RNA–蛋白相互作用的快照可与不同底物一起进行多重分析提供出版级质量图像	程序繁琐，需要变性、杂交和检测检测通常需要信号放大必须保存细胞/组织定量软件是确定共定位所必需的

传统的 FISH 技术使用标记有一至五个荧光团的大寡核苷酸序列，由于非特异性结合和信号放大不足，通常会受到高背景和低灵敏度的限制。Invitrogen ViewRN 测定结合了专有的探针集设计和分支 DNA (bDNA) 信号放大技术。一组大约 20 个寡核苷酸对的靶标特异性探针与目标靶标 RNA 杂交。信号放大通过相邻寡核苷酸对与 bDNA 结构的特异性杂交实现，而 bDNA 结构由前置放大器、放大器和荧光染料偶联物标记探针形成。这种方法具有更高的特异性、更低的背景和更高的信噪比。