透析、脱盐、缓冲液置换和蛋白浓缩概述

既往采用机械破裂方法进行细胞和组织裂解；然而，最近已开发出基于去污剂的溶液，能够高效裂解细胞并分离亚细胞结构而无需进行物理破裂。 在蛋白样品制备过程中，许多去污剂、盐和其他在蛋白提取或 随后的 纯化过程中使用或生成的分子都可能对蛋白功能或稳定性产生不良影响，或干扰下游应用；因此，可能需要使用一种或多种 蛋白质净化 方法去除或减少这些污染物。 特定蛋白质净化方法的选择取决于样品类型和体积、蛋白质（天然或重组）的特性以及可能包括晶体学、质谱、蛋白质标记和其他应用的拟议下游应用。 

一般蛋白质提取工作流程。 从哺乳动物细胞中提取总蛋白的方案包括  培养 并收获细胞，将样品移取至洁净的微量离心管中并立即放置在冰上。然后离心试管以沉淀细胞，并吸入上清液。物理破裂细胞或添加细胞裂解缓冲液后，在冰上孵育。最后，离心样品以收集 上清液，上清液中含总细胞蛋白。

透析是一种经典分离技术，它通过半透膜选择性扩散，帮助去除大分子溶液中的小分子、不需要的化合物。膜的截留分子量（MWCO）由孔径大小决定。将样品和缓冲液（称为透析液，通常是样品体积的 200 至 500 倍）置于膜的相对侧。大于膜孔的样品分子保留在膜的样品侧，小分子通过膜自由扩散，全部透析液达到平衡浓度。这种方式可以使样品中小分子污染物的浓度降低至可接受水平。

透析膜的工作原理。透析膜是一种含有各种尺寸孔的半透膜（通常是一张再生纤维素膜）。大于孔的分子无法通过膜，而小分子可以自由通过。采用这种方式，可使用透析方法对含大分子的样品进行纯化或缓冲液交换。

脱盐是指从样品中去除盐，而缓冲液交换是指用另一组缓冲盐替换一组缓冲盐。这两个目标均可通过尺寸排阻色谱（SEC）轻松实现，也称为凝胶过滤色谱。脱盐通过首先用水平衡色谱柱来实现。而缓冲液交换是通过首先用样品应最终加入的缓冲液平衡色谱柱树脂进行。 在这两种情况下，将样品载入色谱柱的缓冲液成分替换为色谱柱预平衡溶液。 

脱盐和缓冲液交换均为基于凝胶过滤的分离过程，也称为分子筛色谱。 在该方法中，含有大分子的溶液通过采用多孔树脂填充的色谱柱。当色谱柱孔径正确匹配时，大分子因体积过大无法进入树脂孔 中，将迅速通过色谱柱。相反，缓冲盐和 其他小分子将进入树脂孔中，减缓它们通过树脂层的迁移速度。流速降低使得更快的大分子与较慢且较小的分子分离。通过收集从色谱柱中洗脱的单独组分，可将目标大分子与随后自色谱柱洗脱出的小分子分离回收。 

由于将样品载入色谱柱的溶液可替换平衡树脂的溶液，因此从色谱柱中洗脱出的大分子将被运送至平衡缓冲液中。原始缓冲液留在树脂中，故此术语为 " 缓冲液交换 "。

多种商业化脱盐装置可供选择。例如 Thermo Scientific Zeba 产品，含具有出色脱盐和蛋白回收特性的树脂。有几种 Zeba 色谱柱规格可供选择，适用于处理 2 μL 至 4 mL 体积的样品。

与透析类似，渗滤是采用半透膜将大分子与低分子量化合物分离。与透析（依赖于被动扩散）不同，渗滤涉及 通过压力（即反透析，注射器尖端灭菌药筒）或离心使溶液通过膜。 有多种不同类型的蛋白 浓缩仪 可供选择。

在渗滤过程中，水（溶剂）和低分子量溶质均被动通过薄膜过滤，并在另一侧收集。大分子样品保留在膜的样品一侧，随着水被动穿过膜进入另一侧而浓缩至较小体积。 因此，涉及离心的典型渗滤装置被称为浓缩仪，该技术主要用于浓缩样品而非缓冲液置换。

不同供应商的浓缩仪中蛋白质回收率的对比。按照生产商的说明（20 mL（4700 x g）），在 Thermo Scientific 蛋白 浓缩仪 及其他供应商的浓缩仪中离心蛋白样品溶液。离心样品至样品体积减少 15 至 30 倍； 在 A280 通过 吸收率测定蛋白浓度。

常见的蛋白质检测方法依赖于化学反应 或检测试剂与蛋白质官能团相互作用 产生的可测量的显色。然而，即使采用最受欢迎的检测方法，显色和精确的蛋白质测量对 样品 中可能存在的特定干扰物质也很敏感。例如，大多数去污剂会干扰 基于考马斯染料检测方法进行准确的蛋白质定量，而还原剂会干扰 BCA 蛋白 检测。一种用于去除干扰物质的方法是 采用 三氯乙酸（TCA）或丙酮选择性沉淀蛋白质。去除含有干扰物质的溶液， 随后 将蛋白质在检测兼容的缓冲液中解析。市售试剂盒可简化蛋白质分析样品的预处理。小分子可通过乙腈沉淀 与 样品中的大分子蛋白分离。 当与 96 孔离心过滤板结合使用时，该方法适合 一次处理多份样品。

去除干扰比色蛋白检测的物质的方案。 经过4个步骤，  Thermo Scientific Compat-Able 蛋白检测制备试剂套装 可去除 蛋白样品中的盐、去污剂、还原剂和其他物质，从而消除对蛋白检测的干扰。与自制 TCA 或丙酮沉淀试剂相比，该试剂套装可提供更一致的结果。

蛋白纯化或富集的另一种常用方法是离子交换色谱。在离子交换色谱中，样品通过带电荷色谱柱。蛋白表面的带电荷基团与固定在离子交换支持物上的相反电荷基团相互作用。离子交换特性是基于蛋白的等电位点（pI）。当蛋白质在 pH 值高于 pI 的缓冲液中时，蛋白质带负净电荷，并与带正电荷的支持物或阴离子交换介质结合。当缓冲液的 pH 值低于蛋白质 PI 时，蛋白质将带正净电荷并与带负电荷的支持物或阳离子交换介质结合。改变结合缓冲液的 pH 值可使 目标结合蛋白进行洗脱。 蛋白质科学中的现有方案 （1990）。补充8.4 中，John Wiley & Sons， Inc. 提供了深入讨论 

亲和色谱纯化可用于纯化  特定类型的分子（阳性选择）或去除特定类型的污染物（阴性选择）。这两种方法通常都涉及 缓冲液 交换。 亲和色谱纯化涉及根据与配体的结合相互作用差异分离溶液（流动相）中分子    ，该配体通过附着在固定支持物（固相）上而固定。  亲和色谱纯化中的支持物或基质是生物特异性配体共价连接的任意材料。通常，用作亲和基质的材料不溶于发现靶分子所在的系统。不溶性基质通常为固体，但并不总是如此。数百种物质已经过描述并用作亲和基质，包括琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、聚丙烯酰胺、乳胶和可控孔度玻璃。有用的亲和载体应具有高表面积与体积比率、化学基团易修饰以与配体共价键合、最低限度的非特异性结合属性、良好的流动特性以及机械和化学稳定性。

亲和 色谱（AC）。 亲和色谱是基于目标蛋白或一组蛋白与固定在色谱树脂上的特异性配体之间的可逆相互作用。 该过程具有精确选择性，可提供高分离度以及中至高样品加载量。在有利于特异性结合到配体的条件下，目标蛋白质紧密结合到树脂上，并且未结合的污染物被洗掉。然后，通过改变条件以有利于洗脱，以高度纯化的形式回收结合蛋白。洗脱条件可能具有特异性（比如竞争性配体）或者非特异性（比如更改 pH 值、离子强度或极性）。靶蛋白以纯化和浓缩形式进行洗脱。 

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  对蛋白进行分离和分析是实验室常用程序。然而，许多物质会干扰 SDS-PAGE 分析。针对进行 SDS-PAGE 分析的 含 干扰物质样品，市售产品 有助 于加快样品处理。许多市售产品能够快速去除各种化合物，包括高浓度盐、胍、尿素和非离子去污剂。Thermo Scientific SDS-PAGE 样品制备试剂盒  含有一种专有树脂，可在存在有机相的情况下与蛋白结合。洗去任何干扰污染物并   在与 BCA 蛋白检测兼容的缓冲液中洗脱蛋白，从而能够定量分析部分处理样品。

去除去污剂可提高蛋白分离的分离度。使用 Thermo Scientific Mem-PER 试剂盒（产品编号 89826）提取得到的含去污剂、膜（m）和可溶性（s）蛋白组分，使用和未使用 SDS-PAGE 样品制备试剂盒事先处理，通过 SDS-PAGE 进行分离。图像是细胞色素氧化酶亚基 4（COX 4）的化学发光蛋白质免疫印迹结果。试剂盒处理的样品去除了干扰电泳的去污剂，同时保留原始样品的相对蛋白水平。 

Walker JM (2009). The Protein Protocols Handbook.Third Edition. Springer-Verlag New York, LLC.

Asenjo JA, Andrews BA.(2009) Protein Purification using Chromatography: Selection of type, modeling and optimization of operating conditions.J Mol Recognit.22(2):65-76.