交联和蛋白质修饰的概述

研究蛋白质的结构和相互作用以及操作蛋白质以用于亲和纯化或检测程序的多种技术依赖于化学交联、修饰或标记蛋白质的方法。 

交联是通过共价键将两个或两个以上分子化学连接在一起的过程。修饰是指连接或裂解化学基团以改变原始分子的溶解性或其他属性。"标记"通常是指任何形式的交联或修饰，其目的是连接一个化学基团（如荧光分子）以辅助检测，其他文章部分描述了相关内容。

生物学研究中与蛋白质和其他生物分子 "配合使用的整套交联和修饰方法通常被称为"生物偶联或"生物偶联" 技术。（结合是交联的同义词。）

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蛋白质的共价修饰和交联取决于能够与蛋白质中存在的特定类型官能团发生反应的特定化学品的可用性。此外，蛋白质功能和结构是直接的研究重点，或者，如果将在某种技术中使用修饰的蛋白质，则必须保留功能和结构。因此，必须考虑蛋白质的组成和结构以及修饰试剂对蛋白质结构和功能的潜在影响。

蛋白质具有四级结构。它的氨基酸序列是一级结构。该序列的书写始终是从氨基端（N 端）到羧基端（C 端）。蛋白质二级结构是指蛋白质中存在的常见重复元件。二级结构有两个基本元件：α 螺旋和 β 折叠片层。α 螺旋结构是由单个多肽链形成的紧凑型、螺旋状结构。β 折叠片层是由平行或反平行排列的多肽链组成，多肽链由相邻 –NH 和 –CO 基团之间的氢键维持稳定。平行 β 折叠片层的相邻肽链走向相同（即两个 N 端相邻），而反平行 β 折叠片层的相邻肽链走向相反（即，一条链的 N 端与相邻链的 C 端相对）。β 折叠片层可包含两条至五条平行或反平行的多肽链。

三级结构是整条多肽链的三维折叠结构，该结构的稳定性依赖于氨基酸侧链之间的一系列自发的、热力学稳定的相互作用。二硫键模式以及离子和疏水相互作用对三级结构的稳定性有极大影响。四级结构是指两条或两条以上多肽链的空间排列。该结构可以是单体、二聚体、三聚体等。构成蛋白质四级结构的多肽链可能相同（例如，同源二聚体），也可能不同（例如，异源二聚体）

四级蛋白质结构。由肽键连接的氨基酸序列（以由蓝色点表示）构成蛋白质的一级结构。在细胞环境中，组成蛋白质的氨基酸的性质在很大程度上决定了蛋白质功能所必需的更高级结构的自发形成。

功能性蛋白质的完整结构不仅仅涉及四级结构中的多肽链。各种共价修饰通常发生在多肽链的组装过程中或组装后大多数蛋白质经过共翻译和 / 或翻译后修饰。例如磷酸化（丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化）、糖基化和泛素化。

了解这些天然修饰非常重要，因为它们可能会改变物理和化学特性、折叠、构象分布、稳定性、活性， 因此改变蛋白质的功能。翻译后修饰（含义不同于本文所讨论的蛋白质修饰）是一个重要的研究领域；有关该主题的讨论，请参阅相关文献。

由于蛋白质的结构决定了其生物活性，所以蛋白质结构的表征同样是一个重要的研究领域。蛋白质是相对容易操作的分子，蛋白质的交联和化学修饰方法常用于确定单个氨基酸侧链在蛋白质的物理、化学和生物学特性中的作用。此外，一旦了解其生物学特性，蛋白质通常可用于多种应用，例如制备用于免疫检测的抗体 - 酶偶联物。

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尽管蛋白质结构很复杂，包括 20 种不同氨基酸的成分，但只有少量蛋白质官能团包含了实际生物偶联方法的可选靶点。事实上，在交联和化学修饰技术中，仅仅四个蛋白质化学靶点就构成了绝大多数的应用：

• 一级胺 (– NH2)： 该基团存在于每条多肽链的 N 端和赖氨酸（lys，K）残基的侧链中。
• 羧基 (– COOH) ： 该基团存在于每条多肽链的 C 端和天冬氨酸（ASP，D）和谷氨酸（Glu，E）的侧链中。
• 磺基 ( -SH) ：该基团存在于半胱氨酸（Cys，C）的侧链中。通常，作为蛋白质二级或三级结构的一部分，半胱氨酸通过其侧链之间的二硫键 (– S – S –) 相互连接。
• 羰基 (– CHO) ： 这些醛基团可通过糖蛋白质中的氧化碳水化合物基团形成。

位于代表性蛋白质上的蛋白质官能团靶点。该图描述了免疫球蛋白质 (IgG) 的通用结构。 重链和轻链通过非共价相互作用和共价链间二硫键结合在一起，形成双边对称结构H 链和 L 链的 V 区包含免疫球蛋白 (Ig) 分子的抗原结合位点每个 Ig 单体都含有两个抗原结合位点，因此是二价的。铰链区是第一个和第二个 C 区结构域之间的 H 链区域，并通过二硫键连接在一起这种灵活的铰链（存在于 IgG、IgA 和 IgD 中，但不存在于 IgM 或 IgE 中）区域允许两个抗原结合位点之间的距离发生变化还显示了几个官能团，这些官能团是实际生物偶联的可选靶点。

对于这些蛋白质官能团靶点中的每个靶点，都存在一种到几种类型的能够靶向它们的反应性基团，这些反应性基团已被用作合成交联和修饰试剂的基础。 

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交联是通过共价键将两个或两个以上的分子化学连接在一起的过程。交联试剂 （或交联剂）是含有两个或两个以上反应性末端的分子，它们能够或化学连接到蛋白质或其他分子上的特定官能团（一级胺，巯氢基等）。

单个蛋白质上两个基团之间的连接会导致分子内交联，从而使蛋白质三级或四级结构稳定。两个不同蛋白质上基团之间的连接会导致分子间交联，从而使蛋白质 - 蛋白质相互作用稳定。或者，如果样品是两种纯化蛋白质 （例如抗体和酶）的混合物，则分子间交联会产生特异性偶联物，可用于检测程序。最后，蛋白质和固体材料（如玻璃玻片或微珠状树脂）上的化学基团之间的连接会导致蛋白质在表面固定化；蛋白质固定化是多种类型检测试剂盒和亲和纯化系统的原理基础。

因此，交联被用于多种目的，包括：

• 稳定 蛋白质三级和四级结构，用于分析。
• 捕获 和识别未知蛋白质相互作用体或相互作用结构域。
• 偶联 酶或标签到抗体或其他蛋白质。
• 固定化 用于检测或亲和纯化的抗体或其他蛋白质。
• 连接 肽至更大的 "载体" 蛋白质上，以便于处理 / 储存。

交联剂的选择基于其化学反应性（即特定官能团的特异性）以及其他化学特性，这些性质有助于它们在不同特异性应用中的使用：

• 化学特异性，包括试剂两端是否具有相同或不同的反应性基团（即，它是否具有同型双官能或异型双官能结构？）
• 连接臂长度，包括臂是否可裂解（即，是否可以在需要时，使连接键反转或断裂？）
• 水溶性和细胞膜通透性 （即，试剂是否能渗透到细胞中并 / 或交联膜内的疏水性蛋白质？）
• 自发反应性或光反应性基团 （即，试剂一旦加入样品中，是否会立即发生反应，或者，是否能在特定时间激活该反应？）

交联剂示例：BS3

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蛋白质分析和检测技术通常不仅仅需要使用双官能交联剂或活化标记试剂的直接偶联。例如，在许多情况下，需对蛋白质进行专门的修饰，以添加分子质量，提高适于储存的溶解性，或创建一个可在后续反应步骤中作为靶点的新官能团。

简单地说， 蛋白质修饰试剂 是封闭、添加、改变或扩展了官能团分子量的化学品。（从更宽泛的意义上讲，蛋白质修饰还包括用于裂解多肽链的蛋白酶和还原剂，但这些是不同的主题，更适合在其他文章中讨论。）以下三个示例足以说明修饰试剂的类型和用途：

• 聚乙二醇化： 通过化学方法将单链或支链聚乙二醇 (PEG) 基团连接至蛋白质是一种标记或修饰形式，主要用于赋予蛋白质水溶性和 / 或惰性分子质量。经过合成以包含反应性化学基团的聚乙二醇 (PEG) 形式构成即用型、活化聚乙二醇化试剂。 

单链、胺基反应性聚乙二醇化 试剂的示例。

• 封闭硫氢基： 蛋白质硫氢基（半胱氨酸的侧链）是蛋白质结构和功能的重要调节因子。某些试剂能够与硫氢基基团（例如，NEM 或 MMTS）发生永久性或可逆性反应。这些试剂在天然巯氢基上"加盖"非常小的基团，促使可以控制特定酶的活性，以用于特定检测目的。

巯氢基可使用 NEM 和 MMTS 进行封闭。

• 将胺基转化为巯氢基： SATA 和相关试剂含有一个胺基反应性基团和一个受保护的巯氢基基团。通过将化合物与纯化蛋白质进行反应，可将赖氨酸残基的侧链修饰为含有巯氢基基团，以使用巯氢基特异性交联剂或固定化学试剂进行靶向。该方法实际上不会将胺基转化为巯氢基；而是将含巯氢基的基团连接到一级胺。其效果还包括使侧链的长度延长几个埃。

巯氢基可使用 SATA 或 Traut 试剂转化为胺基。

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1. A practical approach to crosslinking.Mattson, G., et al.Molecular Biology Reports (1993) 17:167-183
2. Redox-regulated dynamic interplay between Cox19 and the copper-binding protein Cox11 in the intermembrane space of mitochondria facilitates biogenesis of cytochrome c oxidase.Bodea M, Woellhafa MW, Bohnertb M, Laanb MVD, Sommerd F, Junge M, Zimmermanne R, Schrodad M, and Herrmanna JM.Molecular Biology of the Cell, Volume 26, July 1, 2015.