蛋白质蛋白质相互作用分析概述

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蛋白是一种主力蛋白，能促进细胞中大多数生物过程，包括基因表达、细胞生长、增殖、营养摄取、形态、细胞运动、细胞间通讯和细胞凋亡。但是细胞对多种刺激物作出反应，因此蛋白表达是一个动态过程；用于完成特定任务的蛋白不一定会表达或活化。此外，所有细胞并不相等，许多蛋白以细胞类型依赖性方式表达。蛋白的这些基本特性表明了一种可能难以研究的复杂性，特别是当试图在适当的生物学背景下了解蛋白质功能时。

了解蛋白功能所需的关键环节包括：

• 蛋白质序列和结构 - 用于发现预测蛋白质功能的基序
• 进化病史和保守序列 - 鉴定关键的调节性残基
• 表达谱 - 揭示细胞类型的特异性以及表达如何调节
• 翻译后修饰 - 磷酸化、酰化、糖基化和泛素化都表明了定位，激活和 / 或功能
• 与其他蛋白质的相互作用 - 可以通过了解结合配偶体的功能来外推功能
• 细胞内定位 - 可能排除蛋白质功能的序幕

在20世纪90 年代末之前，蛋白功能分析主要集中在单一蛋白上。然而，由于大多数蛋白质与其他蛋白质相互作用以实现适当功能，应在其相互作用配偶体的背景下对它们进行研究，以充分了解其功能。随着人类基因组的发表和蛋白质组学领域的发展，了解蛋白质如何相互作用以及识别生物网络对于了解蛋白质在细胞内的作用变得至关重要。

蛋白质相互作用从根本上说是稳定或瞬时的，并且两种相互作用都可以是强或弱。稳定的相互作用是与那些作为多亚基复合物纯化的蛋白质相关的作用，这些复合物的亚基可以相同，也可以不同。血红蛋白和核心 RNA 聚合酶是形成稳定复合物的多亚基相互作用的示例。

预期瞬时相互作用可控制大多数细胞过程。正如其名称所示，瞬时相互作用属于临时性质，通常需要一组促进相互作用的条件，如磷酸化、构象变化或细胞离散区域定位。瞬态相互作用可能较强也可能较弱，可能快也可能慢。当与结合配偶体接触时，瞬时相互作用蛋白均参与多种细胞过程，包括蛋白质修饰、转运、折叠、信号传导、凋亡和细胞循环。以下用示意图示例了调节凋亡和抗凋亡过程的蛋白相互作用。 

重BAD蛋白间相互作用。检测组合 A：使用谷胱甘肽树脂 (E1) 和钴树脂 (E2) 串联亲和从 HeLa IVT 裂解物 (L) 纯化的重组轻重 BAD-GST-HA-6xHIS 的考马斯染色 SDS-PAGE 凝胶。显示每柱的流量 (FT)。检测组合 B：细胞存活和细胞死亡 (即细胞凋亡) 过程中 BAD 磷酸化和蛋白相互作用不良示意图。检测组合 C：显示已鉴定的 Akt 共有磷酸化位点 (红色框) 的 BAD 蛋白序列覆盖率。检测组合 D：稳定同位素标记的 BAD 肽 HSSYPAGTEDDEGmGEEPSPFr 的 MS 光谱。

蛋白质通过疏水键合、范德华力和盐桥组合在每种蛋白质的特定结合结构域之中结合相互结合。这些结构域可以是小的结合裂隙或大的结合面，可以只有几个肽长，也可以跨越数百个氨基酸。结合域的大小影响结合的强度。促进稳定蛋白间相互作用的常见表面结构域的一个示例是亮氨酸拉链，该拉链由每个蛋白上的 α-螺旋组成。这些螺旋通过每个 α 螺旋上在肽链之间规则间隔突出的亮氨酸残基的疏水键合，从而平行结合。由于分子填充紧密，亮氨酸拉链为多蛋白复合物提供稳定结合，尽管所有亮氨酸拉链因在 α-螺旋结构中的非亮氨酸氨基酸而不相同结合，从而减少分子填料，因此减少相互作用强度。

两个 Src 同源性 (SH) 结构域 (SH2 和 SH3) 是结合短肽序列的常见瞬时结合结构域的示例，它们通常存在于信号传导蛋白中。SH2 结构域可识别含磷酸化酪氨酸残基的肽序列，通常表示蛋白活化。SH2 结构域在生长因子受体信号传导中发挥关键作用，在此过程中，酪氨酸残基的配体介导受体磷酸化募集下游效应子，这些效应子通过其 SH2 结构域识别这些残基。SH3 结构域通常可识别富含脯氨酸的肽序列，通常被激酶、磷脂质酶和 GTPase 用于识别靶标蛋白。尽管 SH2 和 SH3 结构域通常与这些基序结合，但特定蛋白相互作用的特异性由相应基序中的相邻氨基酸残基决定。

两个或多个与特定功能目标相互作用的蛋白的结果可以通过多种不同的方式得到证明。蛋白相互作用的可测量效应概述如下：

• 改变酶的动力学特性，这些特性可能是因为底物结合或变构效应的细微变化
• 允许通过在结构域或亚基之间移动实现底物通道，最终获得预期的最终产物
• 产生一个新的结合位点，通常用于小效应分子
• 灭活或破坏蛋白质
• 通过与不同结合配偶体的相互作用改变蛋白质对其底物的特异性，例如，证明两种蛋白质都不能单独表现出的新功能
• 在上游或下游事件中发挥调控作用

通常，需要结合多种技术来验证、表征和确认蛋白质相互作用。以前未知的蛋白质可能通过其与一个或多个已知蛋白质的缔合而发现。蛋白质相互作用分析还可能揭示众所周知蛋白质的独特而不可预见的功能作用。发现或验证相互作用是了解这些蛋白质 在体内 何处、如何及在何种条件下相互作用 以及这些相互作用的功能影响之路的第一步。

虽然研究蛋白间相互作用的各种方法和途径太多无法在此描述，但下表和本节的其余部分重点阐述了蛋白间相互作用的常见分析方法以及可使用每种方法进行研究的相互作用类型。总而言之，稳定的蛋白间相互作用最简单分离方法是物理方法如免疫共沉淀下拉试验，因为其蛋白复合体不会随时间而解开。通过首先共价交联蛋白以在 co-IP 或下拉期间冻结相互作用，可通过这些方法识别微弱或瞬时相互作用。或者，交联以及标记转移和远端免疫印迹分析可以独立于鉴定蛋白间相互作用的其他方法进行。

免疫共沉淀 (co-IP) 是一种广泛用于发现蛋白质相互作用的技术。Co-IP的执行方式与 单种蛋白的免疫沉淀 (IP)  基本相同，但用抗体沉淀的靶标蛋白 (也称为"诱饵") 用于从裂解物中共沉淀结合配偶体/蛋白复合物或"猎物"。从本质上讲，相互作用蛋白与靶标抗原结合，因为靶标蛋白会与固定在载体上的抗体结合。通常通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和 Western 印迹分析对蛋白质及其结合配偶体进行检测。当共沉淀相关蛋白时，通常假设这些蛋白与靶标抗原在细胞水平上的功能相关。然而，这只是一个假设，需要进一步核实。

细胞周期蛋白 B 和 Cdk1 的免疫共沉淀。Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠与 Cdk1 复合的 Cdk1 抗体结合。细胞周期蛋白 B 与 Cdk1 结合，并与其结合配偶体一起捕获。

下拉试验方法与免疫共沉淀相似，因为使用微珠状载体纯化相互作用蛋白。尽管如此，这两种方法之间的区别在于 co-IP 使用抗体捕获蛋白复合物，而下拉试验使用 "诱饵" 蛋白纯化裂解物中与诱饵结合的任何蛋白。下拉试验是研究强相互作用或稳定相互作用以及无法进行免疫共沉淀的相互作用的理想选择。

下拉试验一般示意图。下拉试验是一种小规模的亲和纯化实验，类似于免疫沉淀，但是使用某个其它类型的亲和系统替代抗体系统。在这种情况下，亲和系统包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多His或链霉亲和素标记的蛋白或结合结构域，可以分别结合谷胱甘肽、金属螯合物(钴或镍)或生物素包被的琼脂糖微珠。固定化的标签融合蛋白作为"诱饵"以捕获推定的结合蛋白（即"猎物"）。在典型的下拉试验中，固定化的诱饵蛋白和细胞裂解物进行孵育，然后进行规定的洗涤步骤，之后使用特定的竞争性试剂或低pH值或还原性缓冲液进行洗脱并使用凝胶电泳或Western印迹进行分析。

大多数蛋白间相互作用是瞬时的，仅作为细胞内单个级联或其他代谢功能的一部分发生。交联相互作用蛋白是稳定或永久加入相互作用复合物组分的方法。一旦相互作用的组分共价交联，则可使用其他步骤 (例如细胞裂解、亲和纯化、电泳或质谱分析) 来分析蛋白质与蛋白质之间的相互作用，同时保持原始的相互作用复合物。

可向细胞中添加同型双功能胺反应性交联剂，以交联可能相互作用的蛋白，然后通过 Western 印迹法裂解后进行分析。交联剂可能具有膜通透性，如 DSS，用于交联细胞内蛋白，它们也可能具有非膜通透性，如 BS3，用于交联细胞表面蛋白。此外，一些 交联剂可以通过还原剂 (如 DSP 或 DTSSP) 来反向交联。

或者，包含光活化基团的异型双功能交联剂 ( 如 SDA 产品或 Sulfo-SDA) 可用于捕获可能发生的瞬态相互作用，例如在特定刺激后。光活化也可以在使用光活化氨基酸 (如 L-光反应-亮氨酸或 L-光反应-蛋氨酸) 进行代谢标记后进行。

使用质谱可以通过高精度地映射蛋白之间的交联位点，尤其是当使用 DSSO 或 DSBU 等 MS 可裂解交联剂时。  

标记转移涉及交联相互作用分子 (即诱饵和猎物蛋白) 与标记交联剂，然后裂解诱饵和猎物之间的键合，以便标签保持与猎物连接。该方法特别有价值，因为它能够鉴定与目标蛋白发生弱或瞬时相互作用的蛋白。新的非同位素试剂和方法继续使得这种技术更容易获得，任何研究人员执行起来更简单。

Western 印迹法磺基-SBED 生物素标签转移和分析的实验策略。

正如下拉试验在使用标记蛋白而非抗体检测蛋白间相互作用方面与 co-IP 不同，远端 western 印迹分析与  western 印迹分析不同，因为蛋白间相互作用可通过分别使用纯化的标记诱饵蛋白而非靶蛋白特异性抗体孵育电泳蛋白来检测蛋白间相互作用。采用 "远端" 这一术语就是为了强调这一区别。

分析蛋白间相互作用的远端免疫印迹图。在本示例中，使用标记诱饵蛋白对转印膜或凝胶进行猎物蛋白探查。结合后，使用靶向诱饵标签的酶 (辣根过氧化物酶；HRP) 偶联抗体标记这种相互作用，然后通过酶促化学发光进行检测。可使用抗体检测到的未标记诱饵蛋白、由酶结合链霉亲和素检测到的生物素化诱饵蛋白或通过暴露于膜下检测的放射性标记诱饵蛋白来调整这种通用方法。

1. Golemis E (2002) 蛋白间相互作用：分子克隆手册。Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. p ix, 682.
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