光反应化学交联剂

光活化（或光化学）交联反应需要光能启动。光反应性基团是化学惰性化合物，在暴露于紫外线或可见光时会发生反应。交联应用试剂中使用的几乎所有光反应性基团都需要暴露于紫外光（UV 光）进行分子活化。下图提供了与光活化交联剂和 UV 交联应用配合使用的仪器类型示例。 

代表性紫外灯。Thermo Scientific Pierce 紫外灯 是一种小型多功能紫外灯，有三种波长可供选择：252 nm、302 nm 和 365 nm，特别适合与光活化交联剂和 UV 交联方法配合使用。

对于生物样品和实验的交联和标记应用，光化学反应基团比严格的热化学试剂具有一定的优势。最重要的是，光化学反应基团使在实验的早期步骤添加试剂以及随后在与特定目标生物条件同等的某些后续步骤中开始交联（通过暴露于紫外光）成为可能。此外，许多基团将偶联至它们在短暂的活化时间内所遇到蛋白中的任何一个常见官能团。该特点使基团在捕获蛋白相互作用时特别有用（参见下文的讨论）。

已纳入交联和标记化合物中用于生物偶联技术的光反应性基团包括芳香叠氮化物、叠氮基-甲基-香豆素、二苯甲酮、蒽醌、某些重氮化合物、双吖丙啶和补骨脂素衍生物。对蛋白质生物学研究最有用的是芳香叠氮化物和双吖丙啶。

用于蛋白交联的选定光反应化学基团。传统上，各种芳香叠氮化物（也称为苯基叠氮化物，前两行）使用最为广泛。补骨脂素（右下）几乎仅与 RNA 或 DNA 反应，用于标记核酸或交联并研究蛋白与核酸的相互作用。双吖丙啶（左下）是一类较新的化合物，愈发受欢迎并更多用于蛋白质研究。单键代表标记试剂或交联剂具有反应性基团的一端。

当暴露于紫外光（250 至 350 nm）时，芳香叠氮化物形成一个氮烯基团，可以通过双键开始加成反应，插入 C-H 和 N-H 位点，或随后进行环扩张以与亲核试剂（例如伯胺）反应。当样品中存在伯胺时，后一个反应路径占优势。

由于含硫醇还原剂可将叠氮官能团还原为胺而阻止光活化，因此在光活化之前和期间的所有步骤中，必须避免在样品溶液中使用含硫醇还原剂 （例如 DTT 或 2- 巯基乙醇）。可在多种无胺缓冲液条件下进行反应。如果采用异型双官能团光反应性交联剂，请使用与两种反应性化学官能团兼容的缓冲液。实验必须在柔光下和/或在箔覆盖的反应容器中进行，直至光反应符合预期。通常将手持式紫外灯置于反应液旁并直接在反应液上 （即不通过玻璃或聚丙烯）照亮几分钟完成光激活。

存在三种基本形式的芳香叠氮化物：简单苯基叠氮化物、羟苯基叠氮化物和硝基苯基叠氮化物。通常需要短波长紫外光（例如 254 nm；265 至 275 nm）高效激活简单苯基叠氮化物，而长波长紫外光（如 365 nm；300 至 460 nm）足以激活硝基苯基叠氮化物。由于短波长紫外光可损坏其他分子，硝基苯基叠氮化物通常更适用于交联实验。

用于光活化光化学偶联的芳香叠氮化物反应方案。单键代表标记试剂或交联剂具有苯基叠氮化物反应基团的一端；R 代表含有亲核或活性氢基团的蛋白质或其他分子。粗体箭头表示优势反应路径。卤化芳香叠氮化物可从活化的氮烯态直接反应（无环扩张）。

尽管同型双官能团芳香叠氮化物交联剂在过去已经上市，但与替代品相比，其效用有限，已不再销售（搜索 "双-[β-（叠氮水杨酰氨基）乙基 ] 二硫化物（BASED）"的文献）。几乎所有的芳香叠氮化物试剂应用均涉及异型双官能团化学试剂，其中芳香叠氮化物基团配对不同类型的反应性基团，例如胺反应性 NHS 酯。这些化合物用于各种 bait 和 prey 猎物策略，以研究蛋白-蛋白相互作用或蛋白-核酸相互作用。

1.捕获蛋白质相互作用

异型双官能团 NHS 酯/芳香叠氮化物交联剂在实验中用于发现或分析发生特定蛋白相互作用的条件。

假设一名研究人员已纯化蛋白（X），希望比较第二种蛋白（Y）相对丰度的两种条件，研究人员知道第二种蛋白是 X 的直接结合配偶体。 首先，交联剂在分离状态（且在弱光下）与 X 反应；交联剂以其 NHS 酯末端连接至 X 的表面伯胺，用几种即用激活型芳香叠氮化物基团标记 X。对 X 进行脱盐去除未反应的交联剂后，将 X 加入代表不同处理条件的 Y 样品中 （例如采用不同条件下生长的细胞制备的细胞裂解物）。最后，X 和 Y 经过足够的时间相互结合后，样品经紫外光照射以活化芳香叠氮化物部分，然后将其偶联至其附近的任意蛋白官能团。

如果附近的氨基酸是结合配偶体（Y）的氨基酸，则 X 和 Y 之间将形成共价交联。此时，可以采用多种方式分析结果。假设研究人员有检测 X 的特异性抗体，则可以通过电泳和蛋白质免疫印迹对产品进行分析。偶联的蛋白将作为一个更大的蛋白，而不是分离的单个蛋白运行，并且这种差异可以进行检测和定量。

根据交联剂的间隔长度和可断裂性特点，不同的蛋白相互作用体对可以更有效地进行偶联并采用不同的方式进行分析。含胺反应性、巯基反应性和羰基反应性基团的异型双官能团芳香叠氮化合物均有市售。

2.标记蛋白质相互作用

标记转移是刚才描述的异型双官能团交联的延伸，用于研究蛋白相互作用。除两个交联末端外，这些试剂还掺入了可检测标签或标记（例如荧光基团或生物素）和可断裂的间隔臂（通常为二硫键）。

Sulfo-SBED，一种生物素标记转移试剂。该试剂的特征包括胺反应性 Sulfo-NHS 酯（左下）、芳香叠氮基（左上）、生物素（右）和 NHS 酯臂中的可断裂二硫键。

一旦相互作用蛋白对进行了交联（如上所述假设的蛋白质 X 和 Y），连接它们的间隔臂就可以被断裂。这种方式可分离蛋白质，但将标记（Sulfo-SBED 为生物素）连接至 Y。 从而有效地将生物素标记从 "bait" 蛋白（X）转移至 "prey" 蛋白（Y）。

双吖丙啶化学反应

双吖丙啶是一类较新的光活化化学基团，被掺入各种交联和标记试剂中。双吖丙啶（叠氮戊酰胺酯）部分的光稳定性优于苯基叠氮基团，采用长波长紫外光（330 至 370 nm）更易高效活化。

光活化双吖丙啶会产生反应性碳烯中间体。这种中间体可通过与特定试剂间隔臂长度相对应的距离处任何氨基酸侧链或肽骨架的添加反应形成共价键。

用于光活化光化学偶联的双吖丙啶反应方案。 R 代表标记试剂或具有双吖丙啶反应性基团交联剂的一端；（P）代表蛋白或含有亲核或活性氢基团 R' 的其他分子。

尽管芳香叠氮化物试剂在文献中被更广泛引用，但随着双吖丙啶试剂的广泛供应并在大多数应用中逐渐取代芳香叠氮化物，这种情况可能发生变化。

1.捕获蛋白质相互作用

当提供双吖丙啶等价异型双官能团芳香叠氮化物试剂时，所有类型的蛋白相互作用实验均可进行。目前，有几种类型的双吖丙啶化合物可在相对端具有胺反应性 NHS 酯。

采用双吖丙啶交联剂实现的光活化偶联示例。SDA 是一种 NHS 酯和双吖丙啶异型双官能团交联剂。一种蛋白的伯胺可在黑暗环境中进行标记。随后可将该蛋白添加至复合溶液（例如细胞裂解物）中，使其与特定相互作用体结合。最后，暴露于紫外光启动与任意附近化学基团（即结合配偶体）的偶联。

2.代谢的标记与交联

双吖丙啶基团的稳定性和非常小尺寸特性也可实现涉及代谢标记的交联实验。例如，光反应-L-亮氨酸和光反应-L-蛋氨酸是它们侧链中含有双吖丙啶基团的天然氨基酸类似物。当将这些化合物添加到培养基而不是其天然对应物中时，蛋白合成机制将使用光反应性氨基酸来构建蛋白。 通过这种方式，蛋白质本身就成为用于体内交联策略的交联试剂。

光反应性氨基酸的结构。这些亮氨酸和蛋氨酸的双吖丙啶类似物可通过翻译机制掺入蛋白结构中，作为蛋白相互作用分析的代谢标记形式。

1. Covalent crosslinking of vasoactive intestinal polypeptide to its receptors on intact human lymphoblasts.Wood, C.L. and O’Dorisio, M.S.J Biol Chem (1985) 260:1243-1247
2. Chemical cross-linking with a diazirine photoactivatable cross-linker investigated by MALDI- and ESI-MS/MS.Gomes, A.F. and Gozzo, F.C.J Mass Spectrom(2010) 45:892-9
3. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin to the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle.Krieg, U.C., Walter, P. and Johnson, A.E.
   Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83:8604-8606