蛋白酶和磷酸酶抑制剂是大多数细胞裂解和蛋白质提取程序中必不可少的成分。这些抑制剂可阻断或灭活细胞裂解过程中从亚细胞区室释放的内源性蛋白水解酶和磷酸化酶，否则它们会降解目标蛋白及其激活状态。

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什么是蛋白酶（蛋白水解酶）和磷酸酶？

蛋白酶和磷酸酶是活细胞中多种生物化学途径中的重要酶。许多细胞功能都需要蛋白酶，包括细胞修复和细胞外物质的消化。磷酸酶在调节真核细胞中的信号转导事件中发挥着关键作用。蛋白激酶将磷酸从 ATP 转移到蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上；磷酸酶则移除磷酸基团。磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见的，其中约 80% 发生在丝氨酸上，20% 发生在苏氨酸上，0.1% 至 1% 发生在酪氨酸残基上。

所有生物体都含有蛋白水解酶（蛋白酶和肽酶）。在完整细胞中，蛋白酶和磷酸酶活性受到细胞区室或抑制剂的严格调控，以防止对细胞蛋白造成无差别破坏，并维持信号传导途径的正常功能。细胞裂解会破坏受严格控制的细胞环境，导致蛋白酶和磷酸酶失去控制。这种失控状态通常会导致总蛋白的回收率降低，以及蛋白活性（即磷酸化状态）的生物学意义丧失。

Graphical depiction of cellular compartments that control protease and phosphatase activities, but cellular disruption leads to all proteins being accessible for degradation
细胞裂解过程中的蛋白降解。许许多细胞蛋白与蛋白水解酶分离。蛋白质提取过程中细胞和组织结构的破坏会改变 体内 状态，使所有蛋白质都有可能被内源性蛋白酶和磷酸酶降解或修饰。由此产生的无节制的蛋白水解活性会降低蛋白质的产量和功能。可以在裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以防止提取的蛋白质降解，并在细胞裂解后获得尽可能高的蛋白质产量和活性。


抑制蛋白酶和磷酸酶活性

蛋白酶抑制剂是生物或化学化合物，通过与蛋白酶可逆或不可逆的结合发挥作用。根据参与肽键断裂的功能基团，大多数已知的蛋白酶属于四个进化上不同的酶家族之一。已知的磷酸酶专一性裂解丝氨酸-苏氨酸或酪氨酸磷酸基团。因此，虽然已发现并使用多种化合物来灭活或阻断这些酶，但没有一种化学物质对所有类型的蛋白酶和磷酸酶都有效（见下表）。相反，使用几种不同抑制剂的混合物或抑制剂混合物来确保蛋白质提取物在分析目标之前不会降解。几乎总是需要蛋白酶抑制剂，而磷酸酶抑制剂仅在研究磷酸化状态（激活状态）时才需要。研究实验可能需要使用单一抑制剂或定制混合物，但大多数蛋白质研究最好使用合适的蛋白酶抑制剂混合物。

常用的蛋白酶抑制剂

抑制剂分子量（kDa）靶标类别类型溶解度 (溶剂)典型工作浓度 (1X)
AEBSF239.5丝氨酸蛋白酶不可逆200 mg/mL (H2O)0.2 至 1.0 mM
抑肽酶6511.5丝氨酸蛋白酶可逆10 mg/mL (H2O)100 至 200 nm
贝司他汀308.4氨基肽酶可逆5 mg/mL (MeOH)1至 10 µM
E-64357.4半胱氨酸蛋白酶不可逆20 mg/mL (1:1 EtOH:H2O)1至 20 µM
EDTA372.2金属蛋白酶 (螯合阳离子)可逆性染色10 g/100 mL (H2O)2 至 10 mM
亮抑酶肽475.6丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶可逆1 mg/mL (H2O)10至 100 µM
胃酶抑素A685.9天冬氨酸蛋白酶可逆1 mg/mL (MeOH)1至 20 µM
PMSF174.2丝氨酸蛋白酶可逆18 mg/mL (MeOH)0.1 至 1.0 mM

常用的磷酸酶抑制剂

抑制剂分子量（kDa）靶标类别类型溶解度 (溶剂)典型工作浓度 (1X)
氟化钠42.0丝氨酸/苏氨酸和酸性磷酸酶不可逆40 mg/mL (H2O)1 至 20 mM
正钒酸钠183.9酪氨酸和碱性磷酸酶不可逆20 mg/mL (H2O)1 至 100 mM
β-甘油磷酸（二钠盐）216.0丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆10 mg/mL (H2O)1 至 100 mM
焦磷酸钠221.9丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆65 mg/mL (H2O)1 至 100 mM
Prevention of protein degradation by proteases after cell lysis using various protease inhibitor cocktails

市售蛋白酶抑制剂混合液和片剂对比。 胰蛋白提取物（50μL，1μg/μL 蛋白）或胰蛋白酶（25μL，0.1 单位/μL）与淬灭的 -荧光、可被蛋白酶裂解的半胱氨酸 （A） 或丝氨酸蛋白酶 （B） 底物，在含有或不含市售蛋白酶抑制剂、含 EDTA（蓝色）或不含 EDTA（紫色）的配方中。反应在 37°C 下孵育 2 小时，并在指定的检测发射下测定荧光。显示了每种蛋白酶抑制剂配方的蛋白酶抑制百分比。

推荐阅读

  1. Walker JM (2009) The Protein Protocols Handbook.Third Edition.New York (NY): Springer-Verlag New York, LLC.

阅览此视频，了解如何使用 Thermo Scientific Pierce 磷酸酶和蛋白酶抑制剂片剂

仅供科研使用，不可用于诊断目的。