蛋白定量数据分析

在大多数蛋白定量中，通过将其检测反应与浓度已知的稀释系列标准品的响应进行比较来测定样品蛋白浓度。蛋白样品和标准品以相同的方式进行处理，即将它们与检测试剂混合，然后使用分光光度计测量吸光度。标准品的响应用于绘制或计算标准曲线。然后，将未知样品的吸光度值内代入标准曲线的图或公式中，以确定其浓度。这种用于确定"未知"物质浓度的比较方法在概念上简单而直接。然而，由于移液和稀释步骤、重复评估、空白校正和其他因素，它在检测方案中的实施变得复杂。这些步骤常常导致对获得最终决定所必需的计算产生混淆。

探索 BCA 检测试剂盒探索 Bradford 检测试剂盒蛋白定量技术手册

下表提供了为常见 BCA 测定和 Bradford 测定制备一组蛋白标准品的信息。要继续将 1 mL BSA 标准品 (2 mg/mL) 的内容物稀释到几个干净的小瓶中，最好使用与测试样品相同的稀释剂。

表 1. 微孔板或试管。

表2. 增强型 BCA 蛋白定量试管。

表 3. 微孔板或试管。

表 4. 用于稀释样品的微孔板或试管。

表 5. 微孔板或试管。

立即查看蛋白标准品

如果以完全相同的方式处理，样品的分析反应可以直接相互比较。如果满足以下四个条件，蛋白含量的变化是导致最终吸光度（颜色强度）差异的唯一可能原因：

• 样品溶解在相同的缓冲液中
• 所有样品使用相同的批次和储备的检测试剂
• 所有样品均混合并在相同时间和温度下孵育
• 不会引入移液错误

当然，由于蛋白定量方法的化学差异，不同的蛋白即使在相同浓度下也能产生不同的吸光度值。这被称为"蛋白-蛋白变异"或"蛋白均匀性"，在其他蛋白方法文章中有更详细的讨论。

用于表达标准的计量单位定义是与未知样品计算值相关的计量单位相同（即，未知样品的最终结果将以与标准品所用的相同计量单位表示）。例如，如果标准品以微克/毫升 (μg/mL) 表示，则未知样品的值（通过与标准曲线比较确定）也以微克/毫升表示。

与许多人假设的情况相反，了解测定中每个孔或比色皿中实际加入的蛋白量（例如微克）既没有必要，也没有任何帮助。考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（产品编号 23236）用于测定两种蛋白样品的简单示例：浓度未知的供试品以及浓度为 1 mg/mL (= 1000 μg/mL) 的标准品。 （通常，需要一整套标准品来建立响应曲线，但这是一个简单的示例。）

在微孔板方案中（见图），每个孔添加 10 µL 样品（供试品或标准品）和 300 µL 检测试剂。因为将 10 µL 标准样品添加到孔中，所以孔中的蛋白含量为 0.010 mL x 1,000 µg/mL = 10 µg。 如果检测结果在供试品中具有与标准品相同的最终吸光度，则得出的结论是，供试品含有与标准品相同量的蛋白。由于每个孔中含有 10 µg 标准品，因此可以将测定的供试品浓度报告为 10 µg/孔。然而，每个孔中的蛋白量几乎肯定不是目标值；而是通常想了解原始供试品的蛋白浓度。因为原始标准品为 1000 µg/mL，所以在检测中产生相同吸光度的供试品也必须为 1000 µg/mL。

此外，了解分析试剂中稀释后的蛋白浓度既没有必要，也没有帮助。在上面的示例中，由于 10 µg 标准品在加入 300 µL 检测试剂后被稀释至 310 µL，因此孔中的最终浓度为 10 µg/310 µL = 0.0323 µg/µL = 32.3 µg/mL。因此，可以报告供试品的测定浓度为 32.3 µg/mL。然而，当通过检测试剂稀释时的蛋白浓度几乎不是目标值；而是希望了解原始供试品的蛋白浓度。因为原始标准品为 1000 μg/mL，产生相同检测吸光度的供试品也必须为 1000 μg/mL。

当原始样品相对于标准样品已预先稀释时，稀释因子是需要考虑的重要因素之一。继续使用相同的示例，假设原始蛋白样品实际上已知约为 5 mg/mL。浓度太高，无法通过考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒进行检测，标准微孔板方案的检测范围为 100-1500 μg/mL。然而，可以在缓冲液中将其稀释 5 倍（即，1 份样品加 4 份缓冲液），然后在蛋白测定中将该稀释样品用作供试品。如果供试品产生与 1000 µg/mL 标准品相同的吸光度，则可以得出结论，测试（5 倍稀释）样品为 1000 µg/mL，因此原始（未稀释）样品为 5 x 1000 µg/mL = 5000 µg/mL = 5 mg/mL。

与上面描述的示例不同，大多数检测使用的是一整套蛋白标准品，其浓度涵盖有效检测范围（例如 100-1500 μg/mL）。供试品很少会产生与特定标准品样品之一完全对应的检测响应。因此，需要一种方法来计算或插值标准采样点。

如果供试品产生 0.6 的吸光度，如何使用标准曲线计算蛋白浓度？

大多数酶标仪和分光光度计都配有相关软件，可自动通过标准点绘制最佳拟合（线性或曲线）回归线，在该回归线上插入供试品并报告计算值。选择适当的曲线拟合算法很重要，因为描述拟合曲线的数学公式将用于计算供试品的浓度。

下图展示了不同的曲线拟合算法如何影响蛋白定量计算的准确度。在整个有用的测定范围内，很少有蛋白测定能够达到完美的线性。只要使用适当的曲线拟合，测定就不需要线性即可准确。如果曲线拟合必须手动完成，则点对点拟合通常比整个标准点范围的线性拟合更准确（见图）。"点对点"拟合是每对连续点之间的线性拟合。

下载技术指南：如何使用蛋白定量标准曲线

有几个因素影响蛋白定量的准确度和精度。评估随机误差程度的唯一方法是包括每个标准品和供试品的重复样品。由于所有供试品均通过与标准曲线进行比较来评估，因此将标准品上样三次尤为重要。然后可计算标准差 (SD) 和变异系数 (CV)，从而确保技术人员的移液精度达到一定程度的可靠性。如果使用重复样品，则对平均值（减去明显异常值）进行曲线拟合。

发布的标准曲线图（如本页的图所示）通常显示穿过原点的线 (0,0)。虽然视觉上有吸引力，但这与计算无关。大多数蛋白定量工作试剂在检测波长处具有吸光度（即，即使不存在蛋白，它们也具有正吸光度，参见下图）。

通常做法是从所有其他样品吸光度值中减去零测定标准品的吸光度。但是，如果将使用重复的零测定标准品计算误差统计数据，则空白校正可能需要另一个独立值。如果标准品是在与供试品相匹配的缓冲液中制备，且该缓冲液中含有可能干扰测定化学的组分，则会通过"参比水"（即零蛋白，水样）来对吸光度进行空白对照。然后，水参比样品和零标准样品之间的差异表明了缓冲液效应。

标准曲线斜率与测定准确度和灵敏度直接相关。在其他条件相同的情况下，曲线最陡峭的部分是最可靠的。对于大多数蛋白定量，标准曲线在检测范围的下半部分最陡峭（即具有最大的正斜率）。事实上，检测范围的上限取决于斜率接近零的点；存在的线非常平坦，即使在测量的吸光度差异微小也会导致计算出的浓度出现很大的差异。

然而，检测范围极低的部分虽然具有最陡峭的斜率，但并不总是最佳，因为随机误差和干扰物质在含有极少量蛋白的样品中具有更大的相对影响。因此，通常使用预稀释的供试品获得极清晰的结果，以便其与检测范围的中下部分相对应。许多技术人员会以两到三种稀释度测试样品，以确保至少一种样品"位于"检测范围的此部分。

建议用于每种蛋白检测方法的测量波长最佳，因为它们可产生斜率最大的标准曲线。这通常（但并非总是）与吸光度最大值相对应。（在某些情况下，其他考虑因素对于选择最佳测量波长也很重要，例如避免受在相似波长下吸收的样品成分的干扰）。

事实上，对于大多数蛋白定量，根据所需的精密度，可使用特定范围内的任何测量波长获得可接受的结果。下图说明了这一点（详见技术提示 #25）。

下载技术指南：确定蛋白定量的可接受波长

本文没有讨论干扰物质的可能影响，因为假定所有蛋白样品都经过完全相同的处理，包括溶解蛋白的缓冲液。在这种情况下，缓冲液组分造成的任何干扰对于供试品和标准品都完全相同。然而，样品中的非蛋白质物质会阻碍或加剧测定颜色反应，这是任何蛋白定量系统都面临的重要问题。请参阅相关文章和文档以进一步讨论此主题。

下载技术指南：蛋白定量兼容性表格

1. Bradford, MM. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254.
2. Smith, P.K, Krohn R.I., Hermanson G.T., et al. (1987) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85.
3. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., et al. (1951) Protein measurement with folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193, 265-75.
4. Legler G, Müller-Platz CM, Mentges-Hettkamp M, et al. (1985) On the chemical basis of the Lowry protein determination. Analytical Biochemistry. 150, 278-87.