在免疫印迹过程中成功转印高分子量蛋白质

>在免疫印迹分析过程中，从凝胶向膜可靠转印高分子量 (HMW) 蛋白质（即 150 kDa）是一个常见挑战。多种因素会影响高分子量蛋白质的转移效率。为确定影响蛋白从凝胶至膜转印效率的关键因素，我们进行了一系列实验，以评估在湿式转印、快速半干式转印或快速干式转印中执行该工作流程步骤时的最优方法。

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关于转印效率，大多数现代转印系统可高效转印多种分子量蛋白。大多数现代半干式系统和干式系统均提供预排程序的优化方法，适用于特定分子量范围蛋白，包括高分子量蛋白。无论使用何种系统，转印非常高分子量的蛋白通常需要对方法进行优化。

选择正确的凝胶是成功转印 HMW 蛋白的关键因素。当靶向 HMW 蛋白以进行转印时，最好使用 Tris 乙酸凝胶 或低百分比 Bis-Tris 或 Tris 甘氨酸凝胶。虽然 4-20% Tris 甘氨酸梯度凝胶非常受欢迎，因为其能够分离多种蛋白质 (20-200 kDa)，但不建议将其用于 HMW 蛋白的分离。 >200 kDa 蛋白被压缩至凝胶电泳部分顶部非常窄的区域，从而导致蛋白条带的分离度较差（图 1）。通过使用 Tris 乙酸或低梯度 Bis-Tris 或 Tris 甘氨酸凝胶，可使 HMW 蛋白在凝胶中进一步迁移，从而增加蛋白条带之间的距离。开放基质结构允许 HMW 蛋白在凝胶中迁移更远距离，使得 HMW 蛋白能够更好地从凝胶中转印，从而提高转印效率和灵敏度。通过比较不同凝胶体系和梯度分离 HMW 蛋白质的效果，可以看到 3–8％ 的 Tris 乙酸凝胶对 HMW 蛋白质的分离效果和分离度是最理想的（图 1B）。如 图 2所示，与 4-20% 的 Tris 甘氨酸凝胶相比，使用 Tris 乙酸凝胶可以观察到更好的转移——使用 Tris 乙酸凝胶时可见 9 ng，而使用 Tris 甘氨酸梯度凝胶靶向 ~190 kDA 蛋白表皮生长因子 (EGFR) 时可见 750 ng。

图 1.Tris 乙酸凝胶分离 HMW 蛋白的效果最佳。A. 在选定的 NuPAGE Bis-Tris，Novex Tris 甘氨酸和 NuPAGE Tris 乙酸凝胶上迁移不同分子量的蛋白。B. 使用不同凝胶体系和梯度对 HMW 蛋白分离与 HeLa 细胞裂解物进行比较，结果显示，与常用 4 – 20% Tris 甘氨酸和 8% Tris 甘氨酸凝胶相比，使用 3-8% Tris 乙酸凝胶在裂解物中分离 HMW 蛋白的效果最佳。顶部的红线描绘了凝胶末端的堆积部分以及凝胶起始端的溶解部分。每个泳道中的第二条红线接近 200 kDa 蛋白在电泳期间迁移至凝胶溶解部分的距离。

图 2.使用 iBlot 2 凝胶转印装置对从 Novex 4 – 20% Tris 甘氨酸凝胶和 NuPAGE 3 – 8% Tris 乙酸凝胶转印的 A431 裂解物中的 EGFR 表达进行免疫印迹分析。方法：通过将连续稀释的 A431 细胞裂解物上样至 NuPAGE 3 – 8% Tris 乙酸凝胶（货号 EA03752BOX）或 Novex 4 – 20% Tris 甘氨酸凝胶（WedgeWell 规格）（货号 XP04202BOX）对 EGFR 进行免疫印迹分析。使用 P0 程序（10 分钟）将蛋白通过 iBlot 2 凝胶转印装置转印至硝酸纤维素膜（货号 号 IB23002）。室温下将膜于 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液 （货 号 37565) 中封闭 30 分钟，然后 4°C 下用 EGFR 多克隆抗体 （货 号 PA1-1110）以 1:500 稀释度孵育过夜。孵育过夜后，在 TBST 中洗涤膜并使用 与 Alexa Fluor Plus 800 偶联的山羊抗兔 (H+L) 高度交叉吸附二抗 （货 号 A32735，稀释比为 1:5000）在室温下孵育 1 小时。

iBlot 2 凝胶转印装置 使许多用户能够快速转印多种蛋白。iBlot 2 装置预排程序的默认 7 分钟转印方案通常适用于多种蛋白。 虽然这些条件适用于多种蛋白样品，但您可能需要针对目标蛋白及其各自的分子量进行参数优化。 >相对于较小分子量的蛋白，150 kDa 蛋白在凝胶基质中迁移速度更慢，因此需要更多的转印时间。对于这些高分子量蛋白，无论选择何种类型凝胶，转印时间均应延长至 8-10 分钟。如 图 3所示，在 25 V 下使用 8 – 10 分钟的转印时间可实现 ~190 kDa EGFR 的最高效转印。

图 3.延长转印时间对采用 iBlot 2 凝胶转印装置进行 EGFR 检测的影响。方法：通过将连续稀释的 A431 细胞裂解物按照每孔 20 µg 至 312 ng 上样至 Novex 4 – 20% Tris 甘氨酸凝胶（WedgeWell 规格）（货号 XP04202BOX）对 EGFR 进行免疫印迹分析。通过 iBlot 2 凝胶转印装置 （货号号 IB23002），在 25 V 下使用 P0 程序将蛋白转印至硝酸纤维素膜 6 分钟、7 分钟、8 分钟或 10 分钟。室温下使用 Blocker FL 荧光封闭缓冲液（货号 37565）将膜封闭 30 分钟，然后用 Invitrogen EGFR 多克隆抗体（货号 PA1-1110）以 1:500 稀释度 4°C 孵育过夜。孵育过夜后，在 TBST 中洗涤膜并使用 与 Alexa Fluor Plus 800 偶联的 Invitrogen 山羊抗兔 (H+L) 高度交叉吸附二抗 （货号 A32735，稀释比为 1:5000）在室温下孵育 1 小时。

分子量为 >150 kDa 蛋白的推荐转印参数

如果使用除 Tris 乙酸外的凝胶体系，则在转印前添加快速乙醇平衡步骤，可在不使用理想凝胶体系时，大大增强 HMW 蛋白的转印。使用乙醇对凝胶进行平衡可去除被污染的电泳缓冲盐，并防止转印的传导率增加，从而增加热量产生。此外，乙醇平衡步骤可使凝胶在转印前调整至最终大小。电泳步骤中产生的热量可导致某些凝胶膨胀；乙醇有助于将凝胶收缩至最终大小。为提高转印效率，请在转印前将凝胶浸入 20% 乙醇（在去离子水中制备）中，并于摇床中室温下平衡 5-10 分钟。图 3 表明在转印前使用 20% 乙醇平衡凝胶时，钥孔戚血蓝素（KLH，一种~360-400 kDa 蛋白）的转印效率更高。我们的数据表明，由于这些凝胶的大蛋白转印效率比 Bis-Tris 凝胶更高，因此 Tris 乙酸凝胶可能无需平衡步骤。

以前，半干式转印系统一直被认为是中至低分子量蛋白转印的理想选择，但对高分子量蛋白转印效果不佳。然而，通过改进半干式转印系统并采用更好的耗材，成功使用该技术进行了 HWM 蛋白质转印。使用 Power Blotter 半干式系统时， >150 kDa 蛋白质迁移速度更慢，需要更多时间来转印。如果目标蛋白在该大小范围内，可能需要使用 10-12 分钟的电泳时间，以便使用 1步法转印缓冲液进行转印。与 Power Blotter 等高电流电源搭配使用时，这种高离子强度转印缓冲液可实现快速转印。为直接比较使用快速半干式和湿式转印方法进行 HMW 蛋白转印的效率，采用这些方法平行进行三种 HMW 蛋白靶标 EGFR (190 kDa)、mTOR (289 kDa) 和 Ecm29 (205 kDa) 的免疫印迹检测（图 4）。转印过程完成后对凝胶进行染色，以检查凝胶中残留的蛋白质量。还使用可逆膜染料对膜进行染色，结果显示每种情况的蛋白量相同。蛋白质免疫印迹检测显示，与湿式转印相比，使用 Power Blotter 系统的快速半干式转印可实现对 HMW 蛋白靶标同等或更好的转印。这些结果表明，使用快速半干式转印法进行 HMW 蛋白转印可节省大量时间，而不影响免疫印迹的灵敏度或性能。

为进一步提高 Power Blotter 系统的转印效率，我们建议您使用 Power Blotter 选择膜组。这些预装转印膜组包含一种用于 iBlot 2 转印膜组的独特凝胶基质技术。膜组的凝胶基质结合了优化的阳极和阴极缓冲液，用作离子库，提供缓冲环境。该转印凝胶基质使系统产生高场强，从而提高转印速度和效率。这种结构消除了预制缓冲液或滤纸/膜转印缓冲液中浸泡的必要，尽可能减少了可能导致性能不一致的操作。

推荐用途：

1. 将转印时间延长至 10-12 分钟
2. 使用即用型 Power Blotter 选择膜组

传统上，湿式转印方法因其灵活性而成为检测高分子量蛋白的首选转印技术。该法可以轻松互换不同孔径的转印膜，并可改变转印缓冲液配方。这使得所用凝胶少于理想凝胶体系时，更易于优化高分子量蛋白的转印。使用 Tris 乙酸凝胶时，可使用推荐的 小型凝胶电泳槽 和 SureLock Tandem 中型凝胶电泳槽 转印方案实现高分子量蛋白的高效转印 （图 5）。

分子量为 >150 kDa 蛋白的推荐转印参数

当所用凝胶少于理想凝胶体系时，可能需要对转印缓冲液进行优化。向转印缓冲液中加入 SDS (0.01-0.02%) 可以提高蛋白质在凝胶中的流动性，并有助于将一些更高分子量的蛋白保留在溶液中。同时，由于蛋白的疏水性降低， SDS 可以减少蛋白与膜特异性硝酸纤维素的结合。乙醇对 SDS 的影响相反，可能会降低蛋白在凝胶中的流动性。然而，转印缓冲液中的乙醇可通过从蛋白质中脱模 SDS 并增加与膜的疏水相互作用来改善蛋白质与硝酸纤维素膜的结合。改变转印缓冲液中的乙醇量，添加 SDS 并增加转印时间有助于改善高分子量蛋白的转印效率。

推荐用途：

1. 将转印时间增加 5 或 10 分钟
2. 减少转印缓冲液中的甲醇量
3. 向转印缓冲液中加入高达 0.02% SDS
4. 使用 PVDF 膜

无论何种转印技术，转印后凝胶中通常剩余大量蛋白质。转印效率取决于蛋白质，并根据每个特定蛋白质的大小、丰度、电荷和疏水性而变化。每种蛋白均无法完全转印，尤其是高丰度或过载蛋白。如果在转印后对凝胶进行染色，您将发现，无论何种转印技术，每种凝胶中均残留一些蛋白。然而，膜上通常有足够蛋白可用于后续的免疫印迹检测。

预染分子量蛋白梯被认为是确定蛋白转印效率的一种简单方法。虽然 预染蛋白梯 可以定性监测蛋白转印（例如，在转印夹心中对膜和凝胶正确定位），但其转印至膜上的程度并非是实际蛋白转印效率的准确指示剂。

转印完成后，预染分子量蛋白质梯通常会保留在凝胶中，或者因所用染料，甚至比一些样品的蛋白质迁移效果更好。这并不表示目标蛋白未完全转印。预染蛋白梯含有化学修饰的蛋白。疏水性染料与蛋白梯的共价结合会影响其电荷、溶解度、结合能力和转印效率。因此，预染蛋白梯的转印效率不一定能反映目标蛋白的转印。通常，一部分 HMW 标志物无法从高百分比非梯度凝胶或梯度凝胶中转印出来。这一现象在 4–20% 的 Tris 甘氨酸凝胶中最为明显。

可逆膜蛋白染色是更可靠的转印效率测定方法。为监测转印效率，可使用 Ponceau S、氨基黑 10B 或 Pierce 可逆膜染色剂等染料对膜进行染色以检测总蛋白。因为染料可能会干扰抗体的结合和检测，所以使用易于去除的蛋白质染料最为合适。

• 使用 iBlot 2 凝胶转印装置转印高分子量蛋白质
• 手册：蛋白凝胶电泳技术手册
• 手册：Western Blotting 技术手册
• 手册：蛋白质研究
• 手册：基于抗体的生物医学研究工具