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概述
核转化与叶绿体转化有何区别？

下列文章对叶绿体转化与核转化的优势做了一些讨论，请查看：

  • Fischer et al.  (2004)  Plant-based production of biopharmaceuticals.  Curr Opin Plant Biol 7:152–158.
  • Kindle et al.  (1991_  Engineering the chloroplast genome: Techniques and capabilities for chloroplast transformation in Chlamydomonas reinhardtii.  Proc Natl Acad Sci U S A 88:1721–1725.
使用pChlamy_1或pChlamy_3载体时，由于出现基因沉默而得到较低的表达。你们有何建议？

很遗憾，基因沉默是藻类表达中的一个大问题。沉默程度取决于基因序列和从该基因表达到细胞中的蛋白的毒性。pChlamy_4载体专为避免发生常出现于C. reinhardtii的转基因沉默而设计。同时，该载体经过设计，可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因（sh-ble）的转录融合蛋白。口蹄疫病毒（FMDV）2A肽段的自切序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列，介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。我们使用该系统得到的阳性转化株，即使在有或无筛选压力下传代多次之后，依然能够维持高表达水平，其持续时间远远长于其他系统。

使用pSyn_1载体时，目的基因的基础表达很低。你们有何建议？

pSyn_1的启动子是Psc。Psc是一种弱组成型启动子，可启动目的基因的基础表达。而pSyn_6的启动子是psbA启动子（PpsbA）。PpsbA是细长聚球藻psbA基因（编码光合系统II蛋白D1）的一种强组成型启动子，可启动目的基因的高水平表达。

 

我正在使用藻类MAX Efficiency转化试剂转化衣藻。但是，转化效率非常低。如何能够对此进行改善？

请查看以下建议：

1.     为得到最佳结果，藻类细胞浓度应在1 x 106至2 x 106细胞/mL之间（OD范围为0.3-0.5）。细胞浓度不可超过3 x 106细胞/mL。可通过OD750检测细胞生长，线性范围将在0.2-1.2（在1 cm光路中）之间。如果OD值超出线性范围，请稀释并再次检测以获得准确读数。

公式为：细胞数= (OD750 – 0.088)/ 9 × 106 /mL

2.     线性DNA转化比环状DNA转化的效率高很多（有效率约高出70%）。

3.     DNA的质量和浓度对于转化效率至关重要。您将需要使用PureLink HQ、PureLink HiPure或相同质量的质粒纯化试剂盒进行DNA纯化。使用小体积的浓缩纯化DNA要比使用大体积的低浓度DNA更好。（如果您在转化线性质粒，则在线性化之后，您将需要在转化前使用凝胶提取或PCR净化试剂盒对质粒进行纯化处理。）我们建议每次电穿孔使用2 µg的线性质粒DNA。

4.     质粒DNA是随机插入到基因组的。通常，只有20%的转化株会明显表达目的基因。我们建议首先通过菌落PCR对菌落进行筛选，确保启动子和目的基因的完全整合，随后通过筛选多个阳性克隆，挑选出表达水平最高的克隆。

5.     由于C. reinhardtii基因组具有非常高的GC含量（约62% GC），如果目的基因适应了高表达C. reinhardtii基因的密码子使用偏好，则重组基因的表达水平会明显改善。

6.     由于转化效率取决于构建体向基因组的随机整合，电穿孔结果将取决于目的基因的性质。您可尝试转化试剂盒中的对照载体，从而确认试剂盒及其电穿孔方法是有效的。  

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