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我成功制备了两次Pichia的原生质球，之后就制备不成功了。培养物的OD值根本不降低。

应考虑以下几点：

  1. 如果所用细胞的OD值过高，则它们不能形成原生质球。不要使细胞过度生长。
  2. 不要使用衰老的细胞，应确保细胞处于对数生长期。
  3. 使用前，将酵母裂解酶混合均匀。酵母裂解酶更大程度上是一种悬液，而非溶液。
  4. 每次都使用新鲜配制的PEG溶液，并检查pH。
我的转化失败了。你们有何建议？
  • 应确保收集的是处于对数生长期的细胞（通常OD <1.0）。
  • 如果使用电穿孔法，应查看电穿孔仪使用手册中的推荐条件。可根据需要，改变电穿孔参数。
  • 使用更多的DNA。
  • 使用新鲜配制的感受态细胞。
  • 如果使用LiCl转化法，可尝试煮沸载体DNA。
我在使用Pichia EasyComp™转化试剂盒制备和转化感受态毕赤酵母Pichia pastoris细胞时，得到的转化效率很低。我该怎么办？

以下是可能原因和解决方案：

原因解决方案
溶液I或溶液III的pH发生漂移。两种溶液的pH均应为8.0检查溶液I和溶液III的pH。如果pH低，则通过加入NaOH升高pH。如果pH高，则通过加入HCl降低pH。为了使pH漂移最小化，应将溶液保存在4°C。
孵育期间，未混合转化反应务必在30°C下孵育1小时期间，每15分钟混合一次转化反应。涡旋的效果最好。
孵育时间过短或温度过低毕赤酵母Pichia pastoris转化时，可延长孵育时间（最多3小时）并升高孵育温度（35–37°C）。在某些情况下，这样可能会提高转化效率。
细胞密度过低（OD600 <0.6）按照使用手册第1页第6步“感受态细胞的制备”，将细胞重悬成更小的体积（即，500 μL）。
当使用pPIC6/pPIC6α载体在X-33酵母株中筛选杀稻瘟菌素抗性转化株时，为什么在含300 μg/ml杀稻瘟菌素的YPD培养皿中得到的菌落有大有小？

通常，大菌落代表含pPIC6/pPIC6α整合体的转化株，而小菌落代表含pPIC6/pPIC6α非整合体的转化株。这些非整合体转化株已经转导了pPIC6/pPIC6α质粒，因此，在起始筛选过程中表现出低水平的杀稻瘟菌素抗性。在后续筛选中，这些非整合体转化株不会保持杀稻瘟菌素抗性。

当您为表达实验选择杀稻瘟菌素抗性转化株时，我们建议您从起始转化培养皿中挑选杀稻瘟菌素抗性菌落，然后在第二个含有适当浓度杀稻瘟菌素的YPD培养皿中划线。应选择可保持杀稻瘟菌素抗性的转化株用于下一步研究。

我在使用pPink-HC载体时，宿主酵母株的转化效率非常低。这是为什么？

当使用pPink-HC载体时，宿主酵母株的转化效率较低，是因为仅含低拷贝数ADE2标记物的菌落不能产生足够的ADE2基因产物进行生长，会在缺乏腺苷酸的培养基（即，腺苷酸缺陷型培养基或基本培养基）上被筛选掉。只有整合了多拷贝ADE2标记物的菌落能够在无腺苷酸的条件下生长。由于目的基因与筛选标记物连接，所以白色菌落也能产生更高的目的基因表达。

我将一个菌落接种到25 mL MGY中，过夜生长，但OD值并不在使用手册中所述的2-6之间。哪里出错了？

这可能是因为接种物较少。我们建议使用起始培养物，这比使用菌落更精确。您可使用倍增时间来计算起始OD。在YPD中，倍增时间约为1.5小时。在MGY中，倍增时间约为3小时。

我尝试在Pichia中生成多聚体，但遇到了一些问题。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

问题原因解决方案
转化到E. coli中之后，无多聚体或多聚体数量低

缺乏 CIAP

 

没有足够的DNA片段可用于连接

E. coli中的构建体不稳定

多聚体太长，无法有效连接

使用新鲜的CIAP。
加入更多的CIAP。加入1单位的CIAP，并在37°C孵育超过15分钟。这存在一定风险，因为CIAP可降解DNA末端。

在连接反应中加入更多BamH I-Bgl II表达组件。


减少载体中的表达组件数量。


尝试逐步连接每个表达组件。

重组载体重排，检测到缺失E. coli中的构建体不稳定减少载体中的表达组件数量。
无具有抗生素抗性的Pichia转化株整合效率较低使用更多DNA进行转化和/或使用更多DNA和细胞进行多次转化。
我使用Multi-Copy Pichia表达试剂盒中的pAO815载体生成多聚体，但遇到一些问题。这是为什么？

以下是可能原因和解决方案：

问题原因解决方案
转化到E. coli中之后，无多聚体或多聚体数量低

缺乏 CIAP

 

没有足够的DNA片段可用于连接

E. coli中的构建体不稳定

多聚体太长，无法有效连接

使用新鲜的CIAP。
加入更多的CIAP。加入1单位的CIAP，并在37°C孵育超过15分钟。这存在一定风险，因为CIAP可降解DNA末端。

消化更多含1拷贝表达组件的pAO815。

使用体内方法分离多聚体。

尝试分别连接每个表达组件。

重组载体重排，检测到缺失E. coli中的构建体不稳定使用体内方法分离多聚体。
Pichia His+转化株无多聚体使用错误的酶进行载体线性化（建立多聚体时，5´ AOX1区域的限制性酶切位点被复制）为了将构建体插入到his4，应使用Sal I或Stu I使构建体线性化。
对构建体进行分析，寻找载体骨架上5´ AOX1区域或3´ AOX1区域附近的其他特殊限制性位点。这些位点将保留您的多聚体，并实现与AOX1的重组。
我使用pPIC9K通过体内方法生成多拷贝整合体，但遇到一些问题。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

问题原因解决方案 
假阳性Geneticin抗性水平不足菌落看起来是Geneticin抗性的，但实际上不是。为防止出现这种情况，应在下一步开始之前，纯化您的假定Geneticin抗性菌落，确认每个菌落的Geneticin抗性水平。
分离得到的Geneticin抗性菌落数量较少筛选的His+转化株数量不足自发性多整合事件的发生率仅为1–10%。您需要筛选几千个His+转化株，才能分离得到最佳数量的菌落。
带有目的基因的重组体极少筛选的His+转化株数量不足您需要筛选几千个His+转化株，才能分离得到最佳数量的、带有最多目的基因拷贝数的重组体，因为连续性多次插入事件更罕见。
His+转化株的分离率较低转化效率低使用电穿孔法代替原生质球，可能会提高转化效率，从而分离得到更多的His+转化株。
我在尝试使用S. cerevisiae EasyComp™转化试剂盒来制备和转化酿酒酵母S. cerevisiae感受态细胞，但转化效率很低。我该怎么办？

以下是可能原因和解决方案：

原因解决方案
孵育期间，未混合转化反应务必在30°C孵育1小时期间，每15分钟混合一次转化反应。涡旋的效果最好。
孵育时间过短或温度过低转化时，可延长孵育时间（最多3小时）并升高孵育温度（35–37°C）。在某些情况下，这样可能会提高转化效率。
细胞密度过低（OD600 <0.6）按照使用手册第2页第8步“感受态细胞的制备”，将细胞重悬成更小的体积（即，500 μL）。

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