抗体标记试剂盒

试剂盒足够进行三次独立的标记反应。标记产物适合多种下游应用，包括流式细胞术、荧光显微镜、免疫组织化学、一抗检测、ELISA、免疫细胞化学和间接FISH。只需向含有Zip缓冲液的成分A中加入1mL的水，再加入1mg的抗体，孵育15分钟，您的抗体就完成标记可以使用了（图1）。

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抗体标记试剂盒利用可与氨基反应的Alexa Fluor、Pacific Blue或者Pacific Orange荧光基团，将它共价结合到您的目的IgG抗体上。荧光基团和蛋白之间的共价键非常稳定，而且您所用的荧光基团物与Invitrogen提供的一抗、二级的荧光基团是相同。

这些试剂盒针适用于每次反应标记100µg的抗体。仅需用所提供的缓冲液将蛋白浓度调整到1mg/mL左右，然后将其加到一瓶胺反应性染料中。所有稳定蛋白（如BSA）必须在标记反应前去除。

在分离柱实现对≥40 kDa蛋白的分离（图3）。 整个标记与纯化过程仅需90分钟即可完成，一个试剂盒包含完成五次偶联所需的全部试剂。

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ReadyLabel 抗体标记试剂盒可直接标记成品抗体和细胞培养上清液，无需提前纯化抗体，操作更简单、更省时。ReadyLabel 离心柱含有除杂树脂，可以去除抗体溶液中的蛋白稳定剂（图 3）。标记完成的抗体偶联物可用于流式细胞术、蛋白印迹、ELISA 和间接 FISH。

ReadyLabel 试剂盒配备了我们最受欢迎的染料（Alexa Fluor™ 488、Alexa Fluor™ 647 和生物素），抗体标记产量高、荧光亮度高、可溶性好。需要偶联其他染料？我们还有 ReadyLabel Flex 试剂盒，内含染料以外的试剂盒其他组分，可搭配您自己的染料使用。所有 ReadyLabel 试剂盒均有两种不同的包装规格，分别可用于标记20 μg 和 100 μg IgG，每个试剂盒可进行5次标记。

图 3. 抗体溶液通常含有BSA或其他蛋白稳定剂，以防止蛋白降解。 ReadyLabel 试剂盒内含带除杂树脂的离心柱，可以捕获这些蛋白稳定剂，无需提前进行抗体纯化。 ~20 分钟的上手操作加30 分钟的室温孵育后，您的抗体偶联物就可以使用了。

ReadyLabel抗体标记试剂盒在多重荧光实验中有独特优势。间接检测方法通常受到可用 IgG 种类的限制，现在您可使用ReadyLabel试剂盒直接偶联一抗，突破间接检测的限制、增加多重荧光实验的灵活性。

我们的试剂盒使用了高品质、高亮度的染料，最大限度地减少了荧光背景，助您在实验中得到清晰、精确的信号，进而提高了结果的可靠性和准确性，因此ReadyLabel抗体标记试剂盒非常适合多重荧光实验。

蛋白标记试剂盒采用了胺反应性的荧光基团或半抗原，使其与IgG抗体共价连接。荧光基团和蛋白之间的共价键非常稳定，而且这种标记方法与我们制备Invitrogen一抗和二抗的方法是相同的。

只需将约1mg纯化的IgG（溶于约500μL不含胺基的缓冲液，如Tris中）加入含有已知量的胺反应性染料和一个磁力搅拌棒的小瓶中。使用预填充的纯化柱完成纯化，有较高的抗体回收率（一般>85%）。整个标记和纯化过程可以在90min内完成（手动时间约15min）。游离染料的去除对于标记程度(DOL)的测定至关重要。试剂盒能满足3次偶联反应。

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Zenon标记技术为标记人IgG，小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b抗体以及兔IgG抗体提供了一种通用且操作简单的方法。经过特殊设计的Invitrogen Zenon片段只结合抗体的Fc片段，这种快速、非共价结合方法能够迅速标记微量抗体（图5）。Zenon标记技术简便、高效，标记过程仅需10分钟。

Zenon-抗体复合物形成后，需要加入非特异性IgG来封闭所有未结合的Zenon片段，后续则无需再进行柱纯化。Zenon复合物则可直接加到样品中。

使用Zenon标记技术标记的抗体与市售直标抗体具有相近的荧光强度或酶活性（图6）。

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一般来说，IgG抗体包含两个N-聚糖，它们连接到位于抗体重链Fc结构域的特异性保守天冬酰胺残基上。这些糖链主要是具有两个末端分支的复杂双链聚糖，它们在结构上非常相似，且末端序列高度一致。大多数抗体聚糖分支末端为半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(Gal-GlcNAc-)或N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc-)。用β-半乳糖苷酶去除末端的Gal残基，为随后的酶促β-半乳糖基转移酶（GalT）反应暴露末端GlcNAc标记位点（图7）。在Gal残基被β-半乳糖苷酶切割后，对于一条重链，每个N-聚糖平均含有2个末端GlcNAc残基（每个抗体含有4个末端GlcNAc）。叠氮化物激活的抗体现在可以用二苯并环辛炔（DIBO）功能化的探针通过无铜催化的链接化学进行标记（图8）。

SiteClick方法与许多物种的抗体兼容，包括但不限于人、兔、小鼠、大鼠、羊、仓鼠和鸡。此外，SiteClick标记对几种抗体类别（如IgG、IgM和IgY）都有效，需要注意的是，鸡IgY抗体有6个重链聚糖，而不是2个，因此可以标记到更高的水平。

SiteClick抗体标记系统提供两种试剂盒选择：

• 包含用于制备抗体的叠氮化物修饰成分和标记抗体的sDIBO炔烃的试剂盒（图7A和图7B为完全反应）。
• 仅包含叠氮化物修饰成分的试剂盒（图7A为反应的前2步）。
• 用于标记预修饰抗体的各种sDIBO炔烃试剂也可单独选购（图7B中的步骤）。

这种规格的灵活性具有几个优点，包括能够轻松地改变所用的荧光染料，而不影响相同抗体的标记程度，以及能够制备大量预修饰的抗体，并在需要时只标记少量，再次保持标记程度和功能的稳定性。

与随机标记的胺反应性染料相比，染料与抗体重链Fc结构域的n -链聚糖的共价和位点特异性结合确保了抗原结合位点的免疫原性，从而更有效地结合抗原。在SiteClick标记和胺反应性标记的抗肌钙蛋白I抗体的对比中，SiteClick标记抗体的灵敏度大于胺反应性标记抗体的灵敏度（图9）。

用SiteClick抗体标记系统标记抗体可为您提供可靠数据，即抗体每次都会以相同的方式标记，无需进行反应优化。这意味着每个分子上连接了相同数量的染料，抗原结合位点同样暴露，每次都提供相同的结果。不同抗体之间标记的一致性示例图10。

表 1。标记后一抗的抗原性（图11）。

*Ex/Em=荧光激发和发射波长最大值，单位为nm。
更多关于Alexa Fluor染料和其他荧光染料的信息，请参见荧光染料选择指南

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