一些限制性内切酶显示出“星号活性”，它们切割与它们的识别序列相似的序列。下列一些条件可能会引起星号活性（不同的酶受每种条件的影响不尽相同）。

•不正确的缓冲液条件：确保在单酶切或双酶切时使用推荐的缓冲液。
•孵育时间过长：使用完成酶切所需的最短时间。
•有机溶剂（乙二醇>45%，二甲亚砜（DMSO）>8%，乙醇>12%，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺（DMF），环丁砜）
•高浓度甘油（>5%）。Invitrogen 限制性内切酶（RE）以含有50% w/v甘油的形式提供，因此RE使用量不应超过酶切反应最终体积的10%。
•酶/DNA用量比过高（>25 U/μg）：使用所需的最低量的酶，这将避免将过多的甘油带入反应体系。
• Mn++或其它二价离子替换了Mg++：确保使用推荐的缓冲液。
•高pH值（>8.5）：确保使用推荐的缓冲液。

二甲基亚砜