远蛋白印迹分析 | Thermo Fisher Scientific

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远蛋白印迹分析是分析蛋白质-蛋白质相互作用的另一种方法，它需要用标记的诱饵蛋白探测凝胶电泳分离的蛋白质，然后通过多种方法检测相互作用的蛋白质（猎物）。近年来，远蛋白印迹分析已被用于确定受体-配体相互作用和筛选相互作用蛋白的文库。通过这种分析方法，可以研究翻译后修饰对蛋白质相互作用的影响，使用合成肽作为探针检查相互作用序列，以及在不使用抗原特异性抗体的情况下识别蛋白质相互作用。

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通过远蛋白印迹法研究蛋白质相互作用

远蛋白印迹法与蛋白印迹法的比较

远蛋白印迹技术与蛋白印迹法类似；在蛋白印迹法中，使用抗体检测膜上的相应抗原，而在经典的远蛋白印迹分析中，使用标记的或抗体可检测的"诱饵"蛋白来探测和检测膜上的目标"捕获"蛋白。含有未知猎物蛋白的样品（通常是裂解液）通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或天然 PAGE被分离，然后转移到膜上。转移后，将膜封闭，然后用已知的诱饵蛋白进行检测，通常以纯形式施用；或者，该反应可以在凝胶中进行，如本综述后面所述。诱饵与猎物蛋白反应后，根据所用的诱饵蛋白，检测系统识别与猎物蛋白相对应的条带。

远蛋白印迹分析蛋白质相互作用示意图。在这个例子中，使用标记的诱饵蛋白来探测转移膜或凝胶中的猎物蛋白。一旦结合，酶（辣根过氧化物酶；HRP）结合的抗体就会针对诱饵标签来标记相互作用，然后通过酶化学发光来检测。如下表所示，这种通用方法可以通过使用无标记的诱饵蛋白（由抗体检测）、生物素化的诱饵蛋白（由酶结合链霉亲和素检测）或放射性标记的诱饵蛋白（通过曝光到胶片上检测）进行调整。

蛋白印迹法和远蛋白印迹法的比较

步骤	蛋白印迹法	远蛋白印迹法
凝胶电泳	天然或变性（通常）	天然（通常）或变性
转印系统	最佳膜和转印通过经验确定系统	最佳膜和转印系统通过经验确定
封闭缓冲液	确定最佳阻塞系统通过经验	确定最佳阻塞系统通过经验
检测策略 † （箭头（→）表示检测策略的步骤顺序）	未标记的一抗→ 酶标记的二抗→ 底物试剂	未标记诱饵蛋白→ 酶标记的诱饵特异性抗体→ 底物试剂
	酶标记的二抗→ 底物试剂	放射性标记的诱饵蛋白→ 胶片曝光
	生物素化抗体→ 酶标记的链霉亲和素→ 底物试剂	生物素化诱饵蛋白→ 酶标记的链霉亲和素→ 底物试剂
		融合标记的诱饵蛋白→ 标签特异性抗体→ 酶标记的二抗→ 底物试剂
†标记的抗体通常用酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记。相比之下，诱饵蛋白通常不进行酶标记，因为较大的酶标记可能会在空间上阻碍诱饵蛋白和猎物蛋白之间的未知结合位点。其他标记和检测方案也是可行的。

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远蛋白印迹分析的关键因素

天然捕获蛋白结构在远蛋白印迹分析中的重要性

远蛋白印迹操作必须谨慎小心，以保持所研究蛋白的天然构象和相互作用条件。变性蛋白可能无法与其各自的结合伴侣相互作用，从而导致无法识别相互作用。另一方面，以非天然构象存在的蛋白质可能会以新的、人为的方式相互作用，从而导致假阳性。特别是捕获蛋白，需要进行远蛋白印迹的制备处理步骤，这对蛋白质-蛋白质相互作用的检测会产生重大影响。这并不是说不可能识别有效的相互作用，而是强调在所有远蛋白印迹分析中，适当的验证和控制的使用非常重要。

凝胶电泳

SDS-PAGE（即使用或不使用还原剂进行变性）蛋白质分离法可提供分子量、二硫键的存在以及捕获蛋白亚基组成方面的更多信息，但也会导致捕获蛋白无法识别诱饵蛋白。在这种情况下，应使用天然条件（即非变性且不使用还原剂）下的电泳。

用于 SDS-PAGE 的预制与手工浇注蛋白凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶可以预制并立即使用（左图），也可以在实验室中使用凝胶浇注系统从试剂中制备（右图）。图为 Novex WedgeWell 4-20% Tris-甘氨酸迷你凝胶（左图）和 Invitrogen SureCast Gel Handcast System。虽然制造商之间没有统一的标准，但“迷你凝胶”通常是指厚度为 1 mm、大小约为 8 x 8 cm 的凝胶。盒子的尺寸和槽之间的兼容性各不相同。大多数 Invitrogen 迷你凝胶盒（包括此处所示的盒子）与 Invitrogen 迷你凝胶槽兼容。

蛋白质转移

凝胶分离后，蛋白质通过电泳从凝胶转移到膜上。用于蛋白质转移的膜类型（例如硝化纤维素或聚偏氟乙烯）至关重要，因为某些蛋白质会与特定膜发生选择性或优先结合。蛋白质转移率与蛋白质分子量成反比。在某些情况下，转移条件会改变蛋白质的构象，破坏或阻碍蛋白质上的相互作用位点。

聚丙烯酰胺凝胶电泳正在进行中。 将准备好的凝胶盒放入凝胶槽中，此处使用的是 Invitrogen 迷你凝胶槽，一次可容纳两个迷你凝胶。将蛋白质样品放入孔中后，将凝胶浸入导电的运行缓冲液中，并通电，通常持续 20 至 40 分钟。凝胶的大小、比例以及化学性质不同，运行时间也不同。

对于远蛋白印迹分析，至少不能破坏受体蛋白的相互作用域，或者受体蛋白能够在膜上重新折叠形成三维结构，包括完整的相互作用位点。一般来说，当 SDS 在转移过程中被消除时，蛋白质通常能够更有效地恢复天然状态，因此更容易通过远蛋白印迹法检测到。

如果蛋白质无法重新折叠以形成完整的结合位点，则可添加盐酸胍使膜结合蛋白变性，在去除试剂后，蛋白质会再次发生改变，从而正确折叠。如果蛋白质没有恢复原状，另一种方法是进行凝胶内远蛋白印迹分析，无需将蛋白质转移到膜上（见下文“凝胶内远蛋白印迹检测”）。

封闭缓冲液

将蛋白质转移到膜上后，蛋白印迹法要求用非相关蛋白质溶液封闭膜上未反应的结合位点。通过封闭膜上所有剩余的结合位点，封闭缓冲液可减少非特异性结合，并有助于蛋白质的复性。可以使用多种不同的蛋白质封闭剂，但没有任何一种封闭蛋白溶液适用于所有印迹实验。任何蛋白质封闭剂都可能发生交叉反应，或干扰目标蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

必须根据经验确定有效的封闭缓冲液。牛血清白蛋白 (BSA) 通常用作许多膜探测反应的起点。封闭不足可能会导致背景过高，而封闭时间过长则可能导致信号减弱或被掩盖。在封闭步骤中，蛋白质也会发生复性，因此必须优化封闭条件，以获得每个应用的最佳信噪比。从牛奶或正常血清，到高度纯化蛋白等的多种封闭缓冲液可用于封闭膜上的自由位点。封闭缓冲液应通过减少背景干扰并提高信噪比来提升检测灵敏度。根据抗原本身和所用检测标签的类型，选择合适的封闭液。例如，在使用碱性磷酸酶结合物的应用中，应选择 TBS 封闭液，因为 PBS 会干扰碱性磷酸酶。

SuperBlock 封闭液与牛奶的比较HeLa 细胞裂解液（20、10、5、2.5、1.25、0.625 和 0.3125 µg）的两倍连续稀释液通过 SDS-PAGE 分离并转移到硝酸纤维素（A-C 组）或 PVDF（D-E 组）膜上。用 5% 脱脂牛奶（含 Tris 缓冲液和 0.05%Thermo Scientific Tween 20 洗涤剂）或 Thermo Scientific SuperBlock 封闭缓冲液（含磷酸盐缓冲液和 0.05%Tween 20 洗涤剂）封闭膜 1 小时。使用 Thermo Scientific SuperSignal West Pico 化学发光底物（目录号：34080）处理印迹 5 分钟，然后将其曝光到胶片上。结果表明，SuperBlock 封闭缓冲液在检测目标蛋白方面优于牛奶。

结合和洗涤条件

蛋白质-蛋白质相互作用因相互作用蛋白的性质而异。相互作用强度可能取决于pH值、盐浓度以及与诱饵蛋白孵育时是否存在某些辅助因子。无论必要条件如何，在整个过程中都必须保持这些条件，以维持相互作用，直到能够检测到相互作用为止。这可能影响探测步骤之间所用清洗缓冲液的配方。

检测方法

如上表所示，根据诱饵蛋白上是否存在标签或标记，可采用多种方法检测远蛋白印迹蛋白-蛋白相互作用，包括：

用放射性诱饵蛋白直接检测猎物蛋白
用特异性诱饵蛋白抗体间接检测
用特异性融合标记诱饵蛋白抗体间接检测
用生物素化的诱饵蛋白和酶结合的抗生物素蛋白或链霉亲和素进行间接检测

每种方法都有其优缺点，如下所述。

诱饵蛋白上放射性同位素标记的生成方法有多种。同位素 P-32 通常用于标记融合标记蛋白探针上的磷酸化位点。这种磷酸化方法对蛋白质与蛋白质的相互作用影响不大，因为磷酸化位点位于蛋白质的融合标签部分。另一种放射性方法是直接在诱饵蛋白的内源性磷酸化位点进行标记。然而，只有在 P-32 标记不会干扰诱饵蛋白和猎物蛋白的相互作用时，才能使用这种技术。放射性检测也用于体外翻译过程中掺入 S-35-蛋氨酸的探针。这种方法的一个缺点是，它只能用于含有多个蛋氨酸或半胱氨酸残基的蛋白质探针。

虽然放射性同位素通常不会干扰相互作用，但同位素检测方法也有几个缺点，包括健康危害和处置问题。GST 或组氨酸标记的重组诱饵蛋白通常用针对标记的抗体检测；这两种常用融合标记的抗体都可以在市场上买到。当重组技术无法用于产生融合标记的诱饵蛋白且没有诱饵特异性抗体可用时，可以将诱饵蛋白生物素化，并用标记的亲和素或链霉亲和素检测。

无论使用何种非同位素标记，最后的探测步骤通常需要将抗体或链霉亲和素探针与酶结合，从而产生化学发光反应，该反应可定位到膜或凝胶中的蛋白质相互作用。辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）是最常用的酶标记，其中HRP用途最广。与传统的蛋白印迹法一样，远蛋白印迹法的灵敏度很大程度上取决于用于检测的酶-底物系统。

虽然含有诱饵蛋白的裂解液可用于探测膜，但这会导致背景过高；因此，最好在探测前纯化诱饵蛋白。下面的例子比较了两种用于蛋白印迹法检测的试剂。

蛋白印迹法检测。Thermo Scientific 1-Step Ultra TMB-封闭液的灵敏度与 Thermo Scientific Pierce ECL 蛋白印迹法底物相似。这些试剂可检测辣根过氧化物酶（HRP）的活性。

对照

当通过远蛋白印迹分析鉴定蛋白质-蛋白质相互作用时，重要的是要包含适当的对照，以区分真正的蛋白质-蛋白质相互作用带和非特异性的伪影。例如，涉及重组 GST 融合蛋白检测的实验应与单独的 GST 重复进行。预测相互作用域发生突变的诱饵蛋白可作为对照，用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的特异性。非相关蛋白也可以作为阴性对照与猎物蛋白样品一起处理；理想情况下，这种蛋白的大小和电荷应与被研究的蛋白相似，并且不会与诱饵蛋白相互作用。

在使用辅助系统检测捕获蛋白的方法中，例如酶标记链霉亲和素与生物素化诱饵蛋白，重要的是要包括一个重复对照膜，仅用标记的链霉亲和素进行检测，以发现样品中内源性生物素或标记的链霉亲和素非特异性结合产生的任何条带。当融合标签与相应抗体一起使用时，用仅标记的抗体探测其中一个对照膜至关重要。该对照有助于确认相关条带不是标记的二抗的非特异性结合的结果。为了获得有意义的结果，适当的测试和控制实验应与测试样品同时进行凝胶电泳、转移和探测。

凝胶内远蛋白印迹检测

由于转移过程、阻断以及诱饵蛋白与膜上不相关条带非特异性结合的可能性存在限制，因此有时在凝胶内进行远西式检测更为有利。在此过程中，捕获蛋白样品在天然或变性凝胶中分离。电泳后，用 50% 异丙醇和水对凝胶进行预处理，以去除凝胶中的 SDS，使捕获蛋白重新变性。然后将凝胶与诱饵蛋白一起孵育，通过上述方法之一检测目标蛋白-蛋白相互作用。

优化基于膜的远蛋白印迹所需的相同对照和实验条件也适用于凝胶内检测。凝胶内检测可以省去封闭步骤，但诱饵蛋白和标记的检测蛋白必须在封闭缓冲液中稀释，以减少非特异性结合。此外，与使用等效化学发光底物的膜检测相比，凝胶内检测通常需要更多的捕获蛋白和诱饵蛋白。