SeqStudio 基因分析仪应用

Sanger 测序最常见的应用之一是分析亚克隆中质粒插入的片段。Applied Biosystems BigDye 化学试剂广泛用于 Sanger 测序，是质粒测序工作流程的重要组成部分。SeqStudio 平台的多项新功能为基本质粒测序的研究人员带来了诸多益处。该仪器预装了针对短 (<300 bp)、中 (500 bp) 和长 (> 600 bp) 读取长度优化的测序模块，同时针对特定的需求可在仪器上自定义。可换的卡夹可与单独的项目和用户相关联。基于云端的 Sanger Quality Check 应用程序提供了一组直观的测序图谱分析工具。最后，用于远程监控、访问和共享测序信息的云互连功能可帮助协作者快速分析同一数据集。

通过利用 M13 引物和 Applied Biosystems BigDye Terminator v3.1 化学试剂对 pGEM7zf + 质粒进行测序，确定 SeqStudio 仪器的质粒测序性能。通过赛默飞云平台上的 Sanger Quality Check 模块分析测序图谱来获得结果（图 1）。在所示实例中，针对同一质粒在 16 个孔中进行测序，并在 SeqStudio 基因分析仪上以 4 种不同的加样形式进行分析。注意，每个样品的图谱得分、峰下峰 (PUP) 值、连续读长 (CRL) 和 QV20 +（质量评级 > 20 的长度）相似。在另一条链上的测序图谱中也获得了类似的结果，并且在其他实验中使用 Applied Biosystems BigDye Terminator v1.1 化学试剂也获得了类似的结果。这些数据表明 SeqStudio 平台可以生成高质量的质粒测序结果。

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图 1.使用 Sanger Quality Check Cloud 应用程序分析测序质量。(A) 运行完成后，SeqStudio 仪器将显示生成的序列文件以及每个碱基的质量分数。(B) 在 SeqStudio 仪器上运行 16 个单独的 pGEM7zf+ 测序反应，并将 .ab1 文件上传云端进行分析。请注意，在 16 种不同的反应中，所得到的测序指标非常相似。CRL = 连续读长，QV20+ = 质量评级 > 20 的核苷酸数。

临床研究人员可以使用 SeqStudio 基因分析仪来确保金标准质量，以检测和验证肿瘤组织中突变等位基因的存在。SeqStudio 系统集成了以下工具，以简化 Sanger 测序工作流程：

• SeqStudio 基因分析仪预装了运行模块，这些模块针对从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中所提取的片段化 DNA 进行了优化。
• 基于云端的 NGC 模块使得研究人员可使用 Sanger 测序轨迹快速验证在下一代测序 (NGS) .vcf 文件中鉴定出的变异。
• 可以使用 Applied Biosystems Minor Variant Finder (MVF) 软件和 SeqStudio 仪器生成的 Sanger 图谱检测频率低至 5% 的等位基因变异。
• Applied Biosystems BigDye Direct 和 BigDye XTerminator 化学试剂可提供单管测序和产物纯化，简化了 Sanger 测序工作流程。

应用资料：使用 Sanger 测序检测 FFPE 样品中的低频体细胞突变

通过分析从 10 种不同 FFPE 肿瘤样品中提取的基因组 DNA，并确定 4 个不同热点区域的变异频率，从而确定 SeqStudio 基因分析仪检测肿瘤样品突变等位基因的性能。通过 NGS（使用 Ion Torrent Oncomine Oncology Focus Panel）和 Sanger 测序（使用 BigDye Direct/BigDye XTerminator 化学试剂和 MVF 软件）检测突变等位基因频率。SeqStudio 基因分析仪测定的等位基因频率与 NGS 测得的频率高度相关——从约 9% 到约 70%（图 1）。

我们使用含有 Sanger 测序引物的 96 孔板测定 SeqStudio 基因分析仪分析变异频率的能力，而这些 Sanger 测序引物可检测 KRAS 和 NRAS 中最常见的致病突变。SeqStudio 仪器图谱的次要等位基因频率分析能准确地测量 1 ng 的稀释 FFPE 提取 DNA 中的等位基因频率（图 2A）。因此，有检测稀有等位基因需求的研究人员可信赖 SeqStudio 基因分析仪能够从 FFPE 组织得出准确的结果。

最后，基于云端的 NGC 应用程序可通过扩增子和样本整理 Sanger 测序轨迹，并将它们以正确的方向与 .vcf 文件中的候选变异序列比对，从而简化 NGS 鉴定出的变异的确认。为了显示 NGC 应用程序在肿瘤学工作流程中的实用性，我们通过 Sanger 测序确认了使用 Oncomine Oncology Focus 检测组合鉴定出的 NRAS 突变的存在（图 2B）。SeqStudio 结果证实 NRAS (p.Ala59Thr) 中存在突变。因此，NGC 应用程序对测序图谱中最有意义部分的集中和快速检查有助于 NGS 变异确认。

基因组编辑技术，包括 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑事件，正在迅速被大多数生物科学研究人员所接受，并将彻底改变生物学和医疗各领域。赛默飞世尔科技提供基因组编辑项目所需的所有工具。作为此类项目的一个组成部分，SeqStudio 基因分析仪的功能有助于 Sanger 测序分析，并且非常适合基因组编辑工作流程。尤其是其生成的数据能与广泛用于分析基因组编辑事件效率的工具 TIDE（Tracking of Indels by Decomposition）软件兼容。

网络讲座：赛默飞世尔科技产品线解决方案加速基因组编辑工作流程

SeqStudio 基因分析仪在基因组编辑项目中的实用性可通过从 HEK293 细胞中获得的全细胞裂解物来验证，其中 HEK293 细胞已经过基因编辑，并在 HPRT 或 relA 基因座中的靶向位点周围引入了随机缺失。为了确认编辑的位置，将 Sanger 测序图谱上传到云端，并使用 Sanger Variant Analysis 模块进行分析（图 1）。结果表明，基因编辑位置被非常清楚地标识，并且可以通过中断下游的丰富混合基峰来显示。通过使用 TIDE 软件分析这些图谱文件来确定该混合原代培养物中编辑的效率。在每种情况下，使用通过正向和反向产生的数据，每个基因座的缺失谱和频率几乎相同（图 2）。这些频率可以证实对经过相同编辑的细胞群使用 Invitrogen TOPO 克隆和 Sanger 测序的结果。

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图 2.使用 TIDE 软件和 SeqStudio 仪器生成的混合群体测序图谱来分析 HPRT 和 relA 基因座上的两个不同的基因组编辑事件。柱状图表示含有指定数目核苷酸缺失或插入的群体的比例。(A) HPRT 编辑的总效率约为 80%，而 (B) relA 基因座总效率约为 20%。

对人类疾病发展的研究很大程度上依赖于对培养物中生长的分离的人细胞系的分析。然而，越来越公认的问题是体外生长的细胞可能被错误识别或被其他不相关的细胞系污染。研究人员可以通过分析高度可变的短串联重复序列 (STR) 的高度特异性遗传“指纹”来验证细胞系的身份。SeqStudio 平台能与赛默飞世尔科技细胞系鉴定解决方案完美结合。Applied Biosystems Identifiler Plus 和 Identifiler Direct 试剂盒可分别用于纯化和粗提 DNA 的制备，从而用于分析 16 个高度可变的人 STR 基因座（通常用于验证细胞系正确性）。Applied Biosystems GeneMapper 软件可用于分析由 Identifiler 试剂盒识别的等位基因，其能与从 SeqStudio 仪器中获得的数据兼容，结果可用于在 ATCC 或其他 STR 数据库中进行查询以验证正确性。

应用资料：使用 Identifiler 试剂盒和毛细管电泳平台鉴定人体细胞系

为证明 SeqStudio 仪器在细胞系鉴定工作流程中的实用性，我们从五种不同的常用人细胞系获得了关于 STR 的等位基因信息。即时在低至 300 pg gDNA 的情况下，我们也成功验证了细胞系的身份。为展示检测污染细胞的能力，我们将一个 M4A4GFP 细胞群掺入到不同量的 HeLa 细胞中，并使用 Identifiler Direct 试剂盒进行分析。即使在只有 10% 的细胞群体为 HeLa 细胞的情况下，我们也成功检测到 HeLa 细胞特异性等位基因（图 1）。因此，当与 Identifiler 试剂盒配合使用时，SeqStudio 仪器是细胞系鉴定解决方案的核心部分。

图 1.SeqStudio 仪器上的细胞系污染分析。将 HeLa 细胞和 M4A4GFP 细胞悬浮液稀释至 5×10⁵ 细胞/mL，以指定的比例混合，并点样至 NUCLEIC-CARD 样品收集装置上。当 HeLa 细胞群占约 20% 时，可高度可靠地检测到污染的 HeLa 细胞；然而，当 HeLa 细胞群占约 10% 时，某些 HeLa 细胞特有的等位基因也可以被检测到。

多重连接依赖性探针扩增是一种广泛用于研究由基因座拷贝数变化引起的遗传性人类疾病的一种方法。该方法由 MRC Holland 开发并商业化，可以分析多达 50 个与目标基因座杂交的相邻定位的多对探针。由于具备分析 MLPA 探针扩增子所需的高动态范围、大小分析精确度和峰高保真度，SeqStudio 系统成为进行 MLPA 分析的理想平台。在 SeqStudio 仪器上所获得的结果能够与 MRC Holland 用于分析 MLPA 数据的 Coffalyzer.Net 软件相兼容。

使用 SeqStudio 仪器上的 MLPA 分析两份样品，一份 DNA 样品来自携带杜氏肌营养不良症 (DMD) 基因的外显子 2-30 重复的探针，另一份正常样品使用来自 MRC Holland 的 P034 DMD 检测体系。这些样品的峰高和相对大小可以直接转化为对含有重复的区域的准确检测（图 1）。使用大小缺失探针获得了类似的结果。因此，SeqStudio 仪器可以作为含 CNV 区域的 MLPA 研究综合工具。

应用资料：SeqStudio 基因分析仪上的 MLPA 分析

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基因组数据的现成可用性，为通过对“指纹”基因座的 DNA 进行测序来鉴定未知样品中的物种提供了机会。Applied Biosystems 系列试剂盒（例如 MicroSEQ 试剂盒）通过对核糖体 DNA (rDNA) 序列进行 Sanger 测序简化了原核生物和真菌的鉴定。与此类似，研究人员可以使用线粒体特异性基因座作为鉴定基因座来鉴定真核生物。该策略已在生命条形码计划 (barcodeoflife.org) 中应用，提供了一种快速确定未知真核生物样品身份的手段。

为展示 SeqStudio 基因分析仪应用于微生物鉴定的性能，我们从 ATCC 获得了多种微生物的基因组 DNA 样品，并使用 Applied Biosystems MicroSEQ 500 PCR 试剂盒和 SeqStudio 仪器进行测序。使用 BLAST 数据库对所得到的序列进行检索。对于每个测序反应，将具有最高 BLAST 置信度的生物体作为正确物种。同样，通过使用鱼类线粒体序列（CO1 基因）和鱼类样本的引物，BLAST 置信度最高的结果被成功识别为鱼类。BLAST 检索物种的准确识别说明 SeqStudio 平台可用于物种鉴定。

表 1.使用 SeqStudio 基因分析仪分析物种 ID。使用 16s rDNA 的引物和 MicroSEQ 试剂盒（BigDye Terminator v1.1 化学试剂），或使用鱼线粒体 CO1 序列的引物和 BigDye Terminator v3.1 化学试剂对从鱼中提取的微生物 DNA 或基因组 DNA 样品进行测序。

单核苷酸多态性 (SNP) 有助于理解基因组如何影响生物表型方面。为分析 SNP 变异，我们开发了 Applied Biosystems SNaPshot 多重系统。通过片段分析对对应于特定等位基因的不同大小的可定制颜色编码片段进行分析。SeqStudio 系统包含促进 SNaPshot 分析的新功能，包括内置大小和峰面积片段分析结果报告功能。此外，由于其具有在一个平板上同时进行片段分析和测序反应的能力，使得研究人员能够在一次运行中同时进行 SNP 分析和 Sanger 测序。

为展示 SeqStudio 仪器在 SNaPshot 工作流程中的功能实用性，我们使用 SNaPshot 多重试剂盒，利用靶向 KRAS G12X 和 G13X 等位基因的探针，对来自 FFPE 保存肿瘤切片的基因组 DNA 进行了收集和分析。SeqStudio 仪器产生的结果清楚地显示了该位置不同等位基因的存在和准确检出数（图 1）。请注意，尽管 SeqStudio 仪器上等位基因的检测十分准确，但由于不同聚合物的化学性质不同，所以与其他平台相比，所有峰的绝对迁移将略有不同。因此，为了保证在将峰与等位基因相关联的时候没有相关不确定性，应该在进行大规模分析之前进行已知等位基因的校准。