动物免疫系统能够产生与抗原特异性结合的抗体，这种能力可用来制造探针，用于在各种研究和诊断应用中检测目标分子。目前还没有其他技术允许研究人员设计和生产这种高特异性的分子识别工具。

几乎所有从事任何类型分子分析的医学或细胞生物学研究人员都以某种形式使用抗体技术。根据特定研究需求，科学家们对抗体生产和纯化的关注程度会有所不同。

探索抗体  抗体纯化方法

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介绍

抗体是由免疫系统产生的对进入体内的外源分子作出反应的宿主蛋白。这些外源分子被称为抗原，免疫系统对其分子识别，导致选择性产生能够结合特异性抗原的抗体。抗体由 B 淋巴细胞产生，并在整个血液和淋巴细胞中循环，这些抗体与特异性抗原结合，使其能够从循环中清除。

动物免疫系统能够产生与抗原特异性结合的抗体，这种能力可用来制造探针，用于在各种研究和诊断应用中检测目标分子。当然，目前还没有其他技术允许研究人员设计和生产这种高特异性的分子识别工具。除了具有高特异性外，抗体的几个重要特征使其特别有利于开发为探针。例如，除了决定抗原结合的部分外，抗体具有相对均匀和充分表征的蛋白结构，使其能够通过通用方法进行可预测和可重现的纯化、标记和检测。

生产、纯化和修饰抗体以用作抗原特异性探针的程序于 1970 年代和 1980 年代开发，自 Harlow 和 Lane 发表其经典著作《抗体》后，这些程序基本保持不变：1988 年《实验室手册》。

抗体生产和纯化指南

最新的抗体生产和纯化技术手册是任何实验室处理抗体的重要资源。该手册概述了抗体结构和类型，以及有关用于生产、纯化、片段和标记抗体的程序、试剂和工具的技术信息。

抗体生产和纯化指南

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抗体生产

术语"抗体生产"既有一般含义，也有具体含义。从广义上讲，它是指创建可用特异性抗体的整个过程，包括免疫原制备、免疫、杂交瘤创建、采集、筛选、分型、纯化和标记等步骤，以便直接用于特定方法。从更严格的意义上讲，抗体生产是指产生抗体的步骤，但不包括为特定用途而进行的各种形式的抗体纯化和标记。

抗体生产涉及抗原样品的制备及其安全注射到实验室或农场动物体内，以在血清中引发抗原特异性抗体的高表达水平，然后可从动物体内回收。多克隆抗体直接从血清（血液）中回收。单克隆抗体是通过将免疫小鼠分泌抗体的脾细胞与永生骨髓瘤细胞融合，产生单克隆杂交瘤细胞系，从而在细胞培养上清液中表达特异性抗体。

成功的抗体生产取决于几个重要步骤和注意事项的精心规划和实施：

  • 合成或纯化目标抗原（例如肽或半抗原）
  • 选择合适的免疫原性载体蛋白
  • 偶联抗原和载体蛋白以产生免疫原
  • 使用适当的时间表和佐剂配方对动物进行免疫
  • 筛选血清（或杂交瘤）以获取抗体滴度和同种型（也称为抗体表征；参见下文）

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抗体纯化

抗体纯化包括从血清（多克隆抗体）、腹水或杂交瘤细胞系培养上清液（单克隆抗体）中分离抗体。纯化方法从非常粗糙到高度特异：

  • 粗糙—包括免疫球蛋白在内的总血清蛋白亚群的沉淀
  • 常规—某些抗体类别（如 IgG）的亲和纯化，不考虑抗原特异性
  • 特异—仅对样品中与特定抗原分子结合的抗体进行亲和纯化

获得可用抗体所需的纯化水平取决于抗体的预期应用。

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抗体表征

抗体表征涉及在整个抗体生产和纯化项目中通常在不同阶段进行的三种活动：

  • 筛选—识别具有抗原结合特异性的抗体样品
  • 滴定—测量抗体浓度和功能测定滴度
  • 分型—确定单克隆抗体类别和亚类标识

在生产过程中，首先需要进行筛选，以确定哪些动物和杂交瘤克隆产生高水平的抗原特异性抗体。这通常使用 ELISA 技术完成。

抗体浓度可以使用一般蛋白检测或物种和免疫球蛋白特异性方法进行估算，例如使用专用微凝集检测试剂盒。抗体滴度与浓度相关，但更具体地是指给定抗体样品的有效效力。测量滴度通常意味着确定在给定测定（如 ELISA）中检测所需的抗体样品的功能稀释度。

分型涉及确定单克隆抗体的类别（例如，IgG 与 IgM）和亚类（例如，IgG1 与 IgG2a）。这是抗体生产中的关键步骤，因为这对于选择合适的分子纯化和修饰方法是必要的。使用商业的即用型抗体分型试剂盒最容易实现分型。

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抗体片段

纯化的抗体可以通过几种方法进行修饰以用于特定用途，方法包括片段化至更小的抗原结合单元，与酶或其他可检测的标记物偶联以及固定至固相支持物。大多数情况下，抗体以全分子形式使用。然而，通过使用去除非必要部分的抗体，可以提高一些技术和实验的性能。

抗体片段化是指裂解整个抗体分子和去除结合抗原不必要部分的程序。Fab 和 F(ab)'2 是研究人员较常创建和使用的 IgG 抗体片段。

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抗体标记和固定

生产和纯化抗体，用作抗原特异性探针。然而，它们在任何给定技术（ELISA、免疫印迹、细胞成像、免疫组织化学）中的效用取决于是否有二级检测抗体的机制。

利用抗体进行免疫沉淀或其他形式亲和纯化的技术取决于将其连接或固定到色谱介质（例如微珠状琼脂糖树脂）的机制。实现这一目标的策略包括与抗体标记相同的考虑因素和化学方法。

了解更多信息：蛋白标记概述

参考文献

  1. Alberts, B., et al.(1983).Molecular Biology of the Cell.Garland Publishing, Inc., New York, NY.
  2. Harlow, E. and Lane, D. (1988).Antibodies: A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
  3. Sites, D.P., et al.(1976).Basic & Clinical Immunology.Lange Medical Publication, Los Altos, CA.