荧光探针

使用荧光基团偶联抗体检测靶蛋白。小鼠皮层神经元中的突触素（红色）和微管相关蛋白 2（MAP2；绿色）分别使用特异性一抗和 Thermo Scientific DyLight 650 偶联的山羊抗家兔或 DyLight 488-Goat 抗小鼠二抗进行荧光标记。均使用 Hoechst 染料标记两面板中的细胞核。

荧光的机制

荧光分子也称为荧光基团或简单称为荧光体，与其他分子相比，它对光具有明显响应。如下文所示，激发光光子被荧光微球的电子吸收，从而将电子的能量水平提高到激发状态。在这一短暂的激发期内，部分能量会通过分子碰撞消散或转移到近端分子，剩余的能量会作为光子发射，从而让电子恢复其基态。由于发射的光子通常携带更少的能量，因此波长比激发光子更长，从而将发射荧光与激发光相区分。荧光基团的激发和光子发射具有周期性，且直至荧光基团发生不可逆地受损（参见见下文的光子漂白）前，其可重复激发。因此荧光基团可以通过该激发和发射周期发射许多光子，可用于多种研究应用。

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荧光的 Jablonski 能量图。

荧光光谱

激发和发射波长都是每种荧光基团的特异性特性，虽然这些波长与单原子荧光基团处于离散状态，但多原子荧光基团表现出广泛的激发和发射光谱。在 X-Y 图上绘制荧光分子（单原子和多原子）光谱，表明与每个荧光基团的最大和最小激发和发射信号强度相对应的波长，如下图（左图）所示。请注意，由于在发射前存在部分能量损失，尽管发射波长与激发波长无关（如上所示），但发射强度与激发波长的振幅成正比，如下图（右图）(2) 中的激发能量（Ex 1 和 Ex2）及其相应的发射强度（分别为 Em1 和 Em2）所示。

荧光基团的激发和发射光谱以及激发振幅和发射强度之间的相关性。荧光基团激发和发射光谱的总图（左）。发射光的强度（Em1 和 Em2）与激发任何激发波长（分别为 Ex1 和 Ex2；右）的荧光基团所需的能量成正比。

斯托克斯位移

激发和发射波长之间的距离称为斯托克斯位移（参见下文），是生物学应用中检测发射荧光的关键方面。斯托克斯位移也是每个荧光基团的明显特征。例如，当使用斯托克斯位移很小的荧光基团（右图）时，对发射荧光进行检测可能很难区分激发光，因为激发和发射波长在较大程度上存在重叠。相反，由于激发波长与发射波长之间存在很大分离，很容易区分具有较大斯托克斯位移的荧光基团（左图）。斯托克斯位移在多通路荧光应用中尤为关键，因为一个荧光体的发射波长可能会重叠，因此会激发同一样品中的另一个荧光体。

荧光基团激发和发射光谱的斯托克斯位移。具有较高斯托克斯位移的荧光基团（左）显示样品中激发光和发射光之间存在清晰区分，而对于斯托克斯位移较小的荧光基团（右），由于激发和发射波长之间的差异较小，则显示更高的背景信号。

电磁频谱指各种电磁辐射波长的较大范围，可见光光谱仅限于这些波长中极小的子集，如下所示。由于对超出可见光谱进行检测时存在限制，因此基于荧光的早期研究应用采用仅在电磁光谱可见光范围 (390 – 700 nm) 中发射的荧光基团。依赖于如今的技术进步，人们能够检测出可见光谱边界以外的荧光基团，并检测到电磁光谱的紫外 (UV) 和红外 (IR) 范围。这些新型荧光基团和检测器为全新和开发的应用提供了更出色的可变性、多功能性和多重检测能力。

指示近似波长的可见光光谱。

特定荧光基团的亮度由摩尔消光系数和量子产率确定，两者均具有特异性。摩尔消光系数 (ε) 定义为在给定波长下可以被荧光吸收的光量（测量单位：M^-1 cm^-1）。量子产率 (Φ) 的计算方式为荧光发射的光子数量除以吸收的光子数量。该计算方式提供了荧光基团的效率，最大值为 1。荧光基团亮度的计算方式为将 ε 和 Φ 相乘。

尽管荧光化学以及技术发现的发展推动了多种不同类型荧光基团的开发，但近 100 年来的生物研究仍然使用了荧光。大量的荧光基团可以为研究应用提供比以往任何时候更高的灵活性、变异性和荧光基团性能。荧光染料可分为三组通用组：

• 有机染料
• 生物荧光基团
• 量子点

每个荧光基团都具有不同的特征，在决定使用哪种荧光基团用于给定的应用或实验系统时，应考虑这一点。

有机染料

荧光素等合成有机染料，是生物学研究中使用的首个荧光化合物。已对此类原始化合物的衍生物进行加工，以提高其光稳定性和溶解度。还针对此类染料开发了衍生物，用于生物偶联，特别是异硫氰酸荧光素 (FITC)、罗丹明（四甲基罗丹明异硫氰酸盐，TRITC）和具有更高性能的市售类型。对于生物偶联策略而言，这些荧光体的小尺寸是优于生物偶联荧光基团的优势，因为它们可以与抗体、生物素或亲和素大分子交联，而不会干扰正常的生物学功能。具有特征激发/发射光谱和极佳量子产率和激发系数的多种染料，可市售用于任何荧光应用。

生物荧光基团

虽然人们已在千年前了解到存在生物发光，但研究应用中的生物荧光基团的首次使用发生在 1990 年代，当时绿色荧光蛋白 (GFP) 由维多利亚多管发光水母克隆而来，作为基因表达报告基因 (3)。自此，原 GFP、藻胆蛋白（别藻蓝蛋白、藻青蛋白、藻红蛋白和藻胆蛋白）以及许多其他蛋白均被设计用于生物表达系统，它们的使用现在在生物研究中已经十分常见。

这类荧光基团的优点在于可将表达质粒引入细菌、细胞、器官或全生物中，以驱动该荧光基团单独表达或在研究的生物过程背景下融合至目标蛋白的表达。使用荧光蛋白可能很耗时，表达将大量产生光蛋白，该蛋白可能会产生活性氧簇，并诱导实际反应或毒性。此外，荧光蛋白的大小可以改变荧光基团融合到的细胞蛋白的正常生物学功能，生物荧光基团通常不会具有合成荧光染料所具有的光稳定性和灵敏度水平。

量子点

量子点是具有独特化学特性的纳米晶体，可严格控制荧光体的光谱特性。量子点于 1980 年代开发，自 1990 年代以来，已越来越多地用于生物研究的荧光应用。量子点是纳米级尺寸 (2-50 nm) 的半导体，在激发时，会根据颗粒的大小发射某一波长的荧光；相较于大量子点，较小的量子点会发射更高的能量，因此随着纳米晶体尺寸的增加，发射光从蓝色转换为红色。由于量子点大小可以严格控制，因此与其他荧光体相比，对于不同的激发和发射波长具有更高的特异性。 

使用 Qdot 二抗偶联物进行多色免疫荧光成像小鼠肾层粘连蛋白被标记上抗层粘连蛋白一抗，用绿色荧光素 Qdot 565 IgG 显色。血小板/内皮细胞黏附分子（PECAM 又名 CD31）被标记为抗 PECAM-1一抗，用红色荧光 Qdot 655 IgG 显色。细胞核使用蓝色荧光素 Hoechst 33342 染色

据报告，量子点比其他荧光基团更具光稳定性，因为一份报告显示，量子点在可在体内成像研究中保持 4 个月的荧光状态 (1)。此外，量子点可以包被用于蛋白标记等不同生物学应用。虽然在生物应用中对量子点的使用处于上升状态，但由于颗粒的分解 (4)，据报告存在细胞毒性，并且其使用成本过高。

检测策略

我们开发了多种不同类型的荧光检测仪器，虽然每种仪器仅适用于都不同的实验方法，但所有荧光检测仪器都具有四种基本要求：

• 激光、光电二极管或灯（氙弧灯和汞蒸汽灯最为常见)等激发光源
• 荧光基团
• 用于分离特定波长以激发不同荧光基团的滤光片
• 记录输出（通常是电子信号）的探测器

虽然此列表并不详尽，并且我们还在不断开发新仪器，但常见的荧光检测仪器包括以下仪器：

• 荧光显微镜 – 检测样品二维和三维的局部荧光剂
• 微阵列读数仪等荧光扫描仪 – 检测样品在两维的局部荧光剂
• 分光光度计和酶标仪 – 记录样品中的平均荧光
• 流式细胞仪 – 分析样品群中单个细胞的荧光

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定量

随着数字显微镜的出现，已能够在在所有荧光应用中普遍发现荧光信号定量的存在，并且能够测量以下各种参数：

• 细胞计数
• 定位于细胞或甚至离散细胞区室的荧光基团量
• 基因表达率和蛋白合成率
• 细胞运动速率或细胞内组分的移动速率
• 样品中的 DNA 量、RNA 量或蛋白量
• DNA、RNA 或蛋白序列
• 酶活性
• 存活率

根据实验方法，荧光定量需要专用软件，可能需要荧光标准品来校准仪器。

荧光标记是将荧光基团共价连接到其他蛋白或核酸等分子的过程。这通常通过使用荧光基团的反应性衍生物实现，该荧光基团可选择性地与靶分子中的官能团结合。最常标记的分子是抗体，抗体可用作检测特定靶标的特异性探针。荧光标记可应用于各种检测系统，并可以进行灵敏和定量测量。

荧光基团偶联

标记分子需要荧光基团的化学反应性衍生物。常见反应性基团包括胺反应性异硫氰酸盐衍生物，包括 FITC、胺反应性琥珀酰亚胺酯，例如 NHS 荧光素或 NHS 罗丹明以及巯基反应性马来酰亚胺活化荧光剂（例如：荧光素-5-马来酰亚胺）。这些反应性染料与另一种分子的反应可形成荧光基团与标记分子之间的稳定共价键。异硫氰酸酯长期以来一直用作主要反应性化学试剂，通过赖氨酸侧链的一级胺将荧光染料与蛋白连接。NHS 酯化学试剂现在是首选标记方法，因为其对一级胺具有更高的特异性，并在标记程序后产生更稳定的键。巯基反应性化学组成在蛋白质标记中的应用范围较小，主要适用于需要保留赖氨酸残基或特异性靶向半胱氨酸残基以在标记蛋白上定位荧光染料的情况。

NHS 荧光素和 FITC 的结构；荧光素的两种胺反应性衍生物。
NHS 光素通过 N羟基琥珀酰亚胺（NHS 酯）官能团激活。与 FITC 相比，NHS 衍生物在存在其他亲核试剂的情况下对一级胺具有更高的特异性，并在标记后产生更稳定的键。

NHS 荧光素和 FITC 的比较。

使用荧光素标记的二抗检测 α 微管蛋白。A549 人肺癌细胞在 96 孔微孔板中生长 18 – 20 小时，使用 4% 多聚甲醛（货号：28906）固定，并使用 0.1% Surfact-Amps X-100（货号：28314）透化处理。使用小鼠抗 α 微管蛋白一抗 (0.4 μg/mL) 和荧光素山羊抗小鼠二抗 (2 µg/mL) 通过探针对细胞进行探查。使用 Hoechst 染料对细胞核进行标记。图像通过荧光显微镜采集。A. 荧光图像显示了仅位于细胞质中的α 微管蛋白（伪彩绿色）的精细网络。B. 使用 Hoechst 染料进行核复染（伪彩蓝色）C. 合并图像。

为检测荧光信号，分子必须被充分标记，同时不干扰分子的功能、溶解性、结合能力或激活性等正常生物特性。因此，荧光标记需要优化。

去除未反应的荧光基团

完成荧光标记反应后，通常需要从标记的靶标分子中去除所有未反应的荧光基团。这通常通过尺寸排除色谱法实现，利用荧光基团、标记蛋白以及核酸等之间的大小差异。然而，许多荧光基团与常规的分离基质相互作用，会导致回收率和分离效果不佳。因此，首选考虑荧光染料疏水特性的专用染料去除柱。使用市售染料去除柱，可以从小至 7kDa、大至 150 kDa IgG 的蛋白中去除染料分子。

淬灭

荧光基团发射可直接受其他荧光或非荧光分子的相互作用影响，而后者可以"猝灭"激发荧光基团发出的荧光。由于可在生物学事件的响应中添加或去除淬灭剂，因此荧光淬灭通常用于确定蛋白的激活状态或识别基因表达。

淬灭程度取决于淬灭剂分子的性质（荧光基团或非荧光基团）、相互作用类型以及荧光体发射的能量波长。荧光猝灭的方法包括荧光共振能量转移 (FRET)、碰撞猝灭和接触猝灭，通过以下图表表示。

在 FRET（也称为 Förster 共振能量转移）中，激发光将"供体"荧光体提高到激发状态，从而导致光子释放。"受体"分子可以是另一个荧光体或非荧光分子，与供体荧光体足够接近，以吸收发射的光子，然后在非荧光分子情况下有效淬灭发射的光。当使用荧光体作为淬灭剂时，发射的光子也会被淬灭，并且如果吸收的光子位于第二荧光体的激发波长范围内，受体电子将被提升至激发状态并在受体荧光体波长处释放光子。另一种作为淬灭剂的荧光体通常用于检测供体荧光体的淬灭状态，因为荧光体并非在应答供体荧光体的激发时检测已知波长的荧光，而是在淬灭荧光体的波长处发射淬灭荧光。

FRET 光谱重叠积分的示意图。该过程是两种染料分子在电子激发状态下之间的距离依赖性相互作用，其中激发作用从供体分子转移至受体分子，而不发射光子。

表 1.Forster Radius 的 R0 典型值 – 注意： Forster 中 O 的上方有两个圆点

接触猝灭发生于激发前荧光基团与淬灭分子复合时；由于荧光体与其他分子直接接触，激发产生的能量立即转移到接触分子，并以热的形式耗散。碰撞淬灭发生于激发荧光基团与溶液中的淬灭剂反应时，能量立即转移到接触的分子，激发荧光体随之弛豫。

荧光淬灭类型图。

背景荧光

在特定实验中，荧光基团检测可能会被高背景荧光干扰，这通常是由于未完全清除未结合的荧光探针或样品自发荧光引起。彻底清洗样品或减少荧光探针的浓度可以降低背景荧光。但是，针对自发荧光问题（定义为样品中组分的内源性荧光），需要考虑正确的探针组合或设备。生物样品中的自发荧光通常在使用较短波长激发光（通常 <500 nm）时发出。因此，可以使用不激发与样品相同光谱的荧光体或滤光片组（专用于将激发光缩小至靶荧光染料的激发光），从而尽可能减少或避免自发荧光。

低荧光

低荧光强度可限制靶荧光基团的检测，在背景荧光较高时尤为如此。荧光强度可通过增加靶位点上的荧光分子数量而增强。这可以通过在实验或扩增方法中使用更高浓度的探针来完成，以增加荧光基团在靶位点的定位。由于增加探针浓度可能会沉淀探针分子并导致细胞畸变（细胞内探针则更为严重）或自淬灭（因为分子间相互作用水平高；参见上文“淬灭”部分）或诱导细胞死亡，因此两种方法都可以对信号检测产生负面影响。

除了累积荧光探针数量外，由于激发强度与激发能量成正比，有时也可通过增加激发光强度来增强低荧光强度。但如下文所述，使用这种方法必须达到平衡，避免荧光褪色。

光漂白

光漂白是荧光团基团因长时间暴露在激发光源下或高强度激发光下发生不可逆破坏的现象。通过将荧光体暴露于可能的极低激发光强度水平，以尽可能缩短或避免光漂白同时还实现极佳信号检测；这需要使用高灵敏度 CCD 相机、高数值孔径物镜和/或超宽带带通发射滤光片优化检测方法。其他方法包括使用比传统荧光基团更稳定的光基团和/或使用抗淬灭剂保护荧光体免受光漂白。避免光漂白的步骤并不适用所有检测方法，应该针对每种方法进行优化。例如，Intifada 试剂对活细胞具有毒性，因此只能用于固定细胞或组织。此外，由于荧光基团在激发源下的曝光时间极短，因此流式细胞术等部分检测方法，通常无需设置避免光漂白的步骤。以下示例说明了荧光光光漂白现象。

Invitrogen Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546 染料、知名荧光素和 Cy3 荧光基团针对光漂白率的对比。牛肺动脉内皮细胞 (BPAEC) 的细胞骨架分别使用 Alexa Fluor® 488鬼笔环肽（上系列）、小鼠单克隆抗 α 微管蛋白抗体及 Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG 抗体标记或荧光素鬼笔环肽（下系列）、抗 α 微管蛋白抗体及市售的 Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体标记。伪彩图像每隔 30 秒拍摄（0、30、90、210 秒曝光）。图片通过适合荧光素和罗丹明的带通滤色片获得。

1. Ballou B. et al.(2004) Noninvasive imaging of quantum dots in mice.Bioconjug Chem.15, 79-86.
2. Encyclopedia of Chromatography: J. Cazes (Ed.); Marcel Dekker Inc., New York, 2001
3. Chalfie M. et al.(1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science.263, 802-5.
4. Mahendra S. et al.(2008) Quantum dot weathering results in microbial toxicity.Environ Sci Technol.42, 9424-30.