荧光基本原理

本页内容

• 荧光过程
• 荧光检测
• 荧光基团的荧光输出
• 荧光的环境敏感性
• 选定的书籍和文章

荧光探针使研究人员能够以极高的灵敏度和选择性检测复杂生物分子组装体（如活细胞）的特定组分。本引言旨为该领域的新手简要介绍荧光原理和技术。

荧光是在某些分子（通常是多环芳烃或杂环克）中发生的第 3 阶段过程的结果，这些分子称为荧光基团或荧光染料（图 1）。荧光探针是一种设计用于对特定刺激作出响应或定位于生物标本的特定区域的荧光基团。 图 2中所示的简单电子状态图（Jablonski 图）说明了荧光探针和其他荧光基团的发出荧光的过程。

第 1 阶段：激发

能量 hν_EX 的光子由白炽灯或激光等外部光源提供，并被荧光基团吸收，形成激发电子单线态 (S₁')。该过程可以区分荧光和化学发光，其中化学发光的激发状态可通过化学反应产生。

第 2 阶段：激发态寿命

激发态的时间有限（通常为 1–10 纳秒）。在此期间，荧光基团经历构象变化，并且与分子环境也可能发生多种相互作用。这些进程有两个重要的后果。首先，S₁' 的能量将部分分散，产生荧光发射源的弛豫的单重态激发态 (S₁)。其次，并非所有最初由吸收激发的分子（第 1 阶段）都能通过荧光发射返回到基态 (S₀)。碰撞淬灭，荧光共振能量转移 (FRET) （注— 1.2 荧光共振能量转移 (FRET)）和系统间交叉（见下文）等其他过程也可能使 S₁消能。荧光量子产率是发射的荧光光子数量（第 3 阶段）与吸收的光子数量（第 1 阶段）的比值，是衡量这些过程发生的相对程度的指标。

第 3 阶段：荧光发射

发射一个能量为 hν_EM 的光子，使荧光基团返回到基态 S₀。由于在激发态寿命期间能量耗散，此光子的能量比激发光子 hν_EX更低，因此波长更长。以 (hν_EX – hν_EM) 表示的能量或波长差异称为斯托克斯频移。斯托克斯频移是荧光技术灵敏度的基础，因为它可在低背景下检测到发射光子，并与激发光子分开。相比之下，吸收分光光度法需要在同一波长下测量相对于高入射光水平的透射光。

荧光光谱

整个荧光过程呈周期性。除非荧光基团在激发态下（一种重要的现象，称为光漂白，参见下文）受到不可逆地破坏，否则可以重复激发和检测同一荧光基团。事实上，一种荧光基团可以产生成千上万个可检测的光子，这是荧光检测技术高灵敏度的基本原理。对于溶液中的多原子分子，图 2 中由 hν_EX 和 hν_EM 代表的离散电子跃迁分别被称为荧光激发光谱和荧光发射光谱的广泛能量光谱所取代（图 3，表 1）。这些光谱的带宽参数对于同时检测两个或多个不同荧光基团的应用尤为重要（参见下文）。稀释溶液中单一荧光基团的荧光激发光谱通常与其吸收光谱相同。因此，吸收光谱可用作激发光谱的替代数据集。在相同条件下，由于激发态寿命期间激发能量部分耗散，荧光发射光谱与激发波长无关， 如图 2所示。发射强度与激发波长处的荧光激发光谱的振幅成正比（图 4）。

表 1.荧光染料的光谱特性。

荧光仪器

从上一次讨论中可以确定荧光检测系统的四个基本要素：1) 一个激发光源（图 5），2) 一个荧光基团，3) 波长滤光片，用于将发射光子与激发光子分开（图 5），4) 一种可记录发射光子并产生可记录输出的探测器，通常用作电信号。无论应用如何，这四种元素的兼容性对于优化荧光检测至关重要。

荧光仪器主要分为四种类型，每种类型能够提供明显不同的信息：

• 荧光计和微孔板读数仪均可测量散装 (µL ~ mL) 样品的 一般 特性。
• 荧光显微镜可将荧光作为微观物体（直径小于 ~0.1 mm）空间坐标的二维或三维函数进行解析。
• 荧光扫描仪（包括微阵列读数仪）可将荧光作为电泳凝胶，印迹和色谱图等宏观物体空间坐标的二维函数进行解析。
• 流式细胞仪可测量流动的细胞流中每个细胞的荧光信号，从而对大样本量中的亚群进行鉴别和定量分析（图 6）。 

使用荧光检测的其他类型仪器包括毛细管电泳仪，DNA 测序仪 和微流体装置。 每种类型的仪器都会产生不同的测量伪影，并对荧光探针有不同的需求。例如，尽管光漂白通常是荧光显微镜中的一个重要问题，但它并不是流式细胞分析的主要障碍，因为激发光束中单个细胞的驻留时间很短。

荧光信号

荧光强度的定量取决于与吸光度相同的参数—由比尔–朗伯定律定义为摩尔消光系数，光程长度和溶质浓度的产物，以及染料的荧光量子产率和仪器的激发光源强度和荧光收集效率（表 1）。在稀释溶液或悬浮液中，荧光强度与这些参数呈线性比例。当样品吸光度在 1 cm 光程内超过约 0.05 时，两者关系呈非线性，测量值可能会被自吸收和内过滤器效应等伪影变形。

由于荧光定量取决于仪器，荧光参比标准品对于校准不同时间或使用不同仪器配置进行的测量至关重要。 为满足这些要求，我们提供了用于荧光显微镜和流式细胞分析的高精度荧光微球参考标准，以及一系列用于光谱荧光计的即用型荧光标准溶液（第 23.1 节—荧光显微镜配件和参考标准， 第 23.2 节—流式细胞分析参考标准)。

光谱仪极其灵活，提供连续的激发和发射波长范围。但是，激光扫描显微镜和流式细胞仪需要使用在单个固定波长下激发的探针。在现代仪器中，激发光源通常是氩离子激光的 488 nm 光谱线。如 图 7所示，较大的荧光斯托克斯频移（即 A1 和 E1 的分离）有助于从瑞利散射激发光 (EX) 分离荧光发射信号 (S1)。用荧光探针标记的生物样品通常包含不止一种荧光物种，从而使信号分离问题更加复杂。如 图 7 所示额外光学信号 S2 可能是由于背景荧光或第二个荧光探针所致。

背景荧光

荧光检测的灵敏度受到背景信号的严重影响，背景信号可能来自内源性样品成分（称为自发荧光）或未结合或非特异性结合的探针（称为试剂背景）。可通过选择降低相对于 E1 的 E2 透射率的滤光片，或通过选择吸收和发射更长波长的探针来尽可能减少自发荧光的检测。尽管缩小荧光检测带宽会提高 E1 和 E2 的分辨率，但它还会影响检测到的整体荧光强度。通过使用可 >在 500 nm 处激发的探针，最容易将细胞，组织和生物液体的自发荧光引起的信号失真降至最低。此外，在更长的波长下，组织等致密介质对光的散射大幅减少，从而使激发光更易穿透。

多色标记实验

多色标记实验需要故意引入两个或多个探针，以同时监测不同生化功能。该技术主要应用于流式细胞分析、 DNA 测序、 荧光 原位 杂交  和荧光显微镜。 通过最大限度地实现多重发射的光谱分离（ 图 7中的 E1 和 E2），有助于信号分离和数据分析。因此，具有较窄发射光谱带宽的荧光基团，如 BODIPY 染料（第 1.4 节—BODIPY 染料系列）和 Qdot 纳米晶体（第 6.6 节—Qdot 纳米晶体），尤其适用于多色应用。多色标记染料的理想组合在激发波长一致且发射光谱分离良好时，表现出强烈的吸收（图 7）。遗憾的是，要找到具有较大吸收消光系数和较大斯托克斯频移所需组合的单一染料并不容易。Qdot 纳米晶体（第 6.6 节—Qdot 纳米晶体）和藻胆蛋白串联偶联物（第 6.4 节—藻胆蛋白）用于满足这些要求，并且已证实其在多色标记实验中有效。

比率式测量

在某些情况下，例如，Ca2+ 指示剂 fura-2 和 indo-1（使用紫外光激发的荧光 Ca2+ 指示剂—第 19.2 节）以及 pH 指示剂 BCECF 和 SNARF（第 20.2 节—在近中性 pH 值下有用的探针），荧光离子指示剂的游离形式和离子结合形式均具有不同的发射或激发光谱。采用这种类型的指示剂，光学信号（ 图 7 中的 S1 和 S2）的比率可用于监测关缔合衡并计算离子浓度。比率式测量可消除因光漂白和探针负载和保留的变化，以及照明稳定性等仪器因素而导致的数据失真  （注 19.1—细胞内离子指示剂的负载和校准）。

比较不同染料

目前用作荧光探针的荧光基团可提供足够的波长范围，斯托克斯频移和光谱带宽，以满足仪器（如 488 nm 激发）的要求，同时可灵活设计多色标记实验。我们的在线 荧光光谱查看器 提供了一种的交互式实用工具，用于在实验设计过程中评估这些因素（注 23.1—使用荧光光谱查看器）。给定染料的荧光输出取决于其吸收和发射光子的效率，以及其经过重复激发/发射循环的能力。吸收和发射效率最有用的量化指标是吸收的摩尔消光系数 (EC) 和荧光的量子产率 (QY)。两者都是特定环境条件下的常数。EC 值是单一波长（通常为最大吸收）处的特定值，而 QY 是测定整个荧光光谱图谱中总光子发射的量度。每种染料分子的荧光强度与 EC 和 QY 的积成正比（表 1)。在有机染料和自发荧光蛋白荧光基团中这些参数的范围是：EC 大约为 5000 至 200,000 cm^-1M^-1，QY 为 0.05 至 1.0。藻胆蛋白（如 R-藻红蛋白）（第 6.4 节—藻胆蛋白）每个蛋白上有多个荧光基团，因此与低分子量荧光基团相比，具其消光系数（约 2 × 10⁶ cm^-1M^-1）要大得多。Molecular Probes ™ Qdot 纳米晶体的消光系数 (>2 × 10⁶ cm^-1M^-1) 甚至更大，尤其是在蓝色可见光和紫外波长区域（第 6.6 节—Qdot 纳米晶体）。

光漂白

在高强度照明条件下，激发荧光基团的不可逆破坏或光漂白成为限制荧光可检测性的主要因素。对导致光漂白的多种光化学反应途径进行了较详细的研究和描述。 一些途径包括相邻染料分子之间的反应，与游离染料稀释溶液相比，这一过程在标记的生物样本中要复杂得多。在所有情况下，光漂白源自三重激发状态，而三重激发态是通过称为跨系统交叉的激发态过程从单线态（S1，图 2）产生。

对光漂白最有效的补救方法是尽可能提高检测灵敏度，以降低激发强度。通过 CCD 相机等低光检测设备，以及高数值孔径物镜和最宽的带通发射滤光片，可提高检测灵敏度，兼容令人满意的信号分离。或者，实验中可能会取代光不稳定性更低的荧光基团。 Molecular Probes ™ Alexa Fluor 488 染料是一种重要的荧光素替代品，光稳定性显著高于荧光素（图 8，图 9， ），但与标准荧光素光学滤光片兼容。Molecular Probes ™ SlowFade 和 ProLong 试剂（第 23.1 节—荧光显微镜配件和参考标准品）等抗淬灭试剂也可用于减少光漂白；然而，它们通常不与活细胞兼容。一般来说，很难预测这种应对措施的必要性和有效性，因为光漂白率在一定程度上取决于荧光基团的环境。

信号放大

增强荧光信号最直接的方法是增加可用于检测的荧光基团的数量。 荧光信号可通过一下方法放大：1) 亲和素-生物素或抗体-半抗原二抗原检测技术；2) 酶标记的二抗检测试剂与荧光底物可结合；  或 3) 包含多种荧光基团（如藻胆蛋白或 FluoSpheres 荧光微球）的探针。我们用于信号放大的最灵敏的试剂和方法在 第 6 章—超灵敏的检测技术中进行了讨论。

单纯增加探针浓度可能会产生相反的效果，而且通常会导致探针的化学和光学特性发生明显变化。请务必注意，通过批量透化方法加载的探针的有效细胞内浓度（注 19.1—胞内离子指示剂的加载和校准）通常会>比细胞外孵育浓度高得多 (10 倍)。此外，对蛋白或膜的标记增加最终导致蛋白沉淀或膜渗透性的总体变化。每个蛋白使用超过 4 至 6 个荧光基团标记的抗体时，抗体的特异性和结合亲和力可能降低。此外，在高度取代的情况下，每个添加的荧光基团所获得的额外荧光通常会由于自淬灭而减弱（图 10）。

荧光光谱和量子产率通常比吸收光谱和消光系数更依赖于环境。例如，将单个荧光素标记偶联到蛋白质上通常可以降低荧光素的 QY 约 60% ，但只会降低 其 EC 约 10%。两个相邻荧光基团之间或周围环境中的荧光基团与其他物种之间的相互作用均可产生环境敏感荧光。

荧光-荧光相互作用

荧光淬灭可定义为双分子过程，可在不改变荧光发射光谱的情况下降低荧光量子得率(表 1)；其可能由瞬时激发态相互作用(碰撞淬灭)或形成的非荧光基态物种引起。自淬灭是一个荧光基团被另一个荧光基团淬灭； 因此，当使用较高上样浓度或标记密度时会发生这种情况（图 10，图 11）。DQ 底物（第 10.4 节—检测肽酶和蛋白酶）经过严格标记，因此高度淬灭生物聚合物，在酶切割后显示出显著的荧光增强 （图 12）。

其他环境因素

许多其他环境因素均会对荧光特性产生影响。最常见的三个因素如下：

• 溶剂极性（该背景下的溶剂包括细胞、蛋白质、膜和其他生物分子结构的内部区域)
• 淬灭物种的接近程度和浓度
• 水介质的 pH 值

荧光光谱可能很大程度上取决于溶剂。这种特征最常见于具有大激发态偶极距的荧光基，会导致荧光光谱在极性溶剂中向较长波长偏移。具有代表性的荧光基团包括氨基萘 [如 Prodan，Badan（图 14）和丹酰]，例如,它们是蛋白内部环境极性的有效探针。

探针与靶标结合可显著影响其荧光量子产率（注 9.1—使用环境敏感染料监测蛋白折叠过程）。探针在与特定目标结合时荧光量子产率较高，但是在其他情况下实际上并未产生荧光，因此试剂背景信号极低。超灵敏 SYBR、SYTO、PicoGreen、RiboGreen 和 OliGreen 核酸染色剂（第 8 章—核酸检测和分析）是这一策略的主要示例。同样，荧光酶底物不发荧光，或者在通过酶促切割转化为荧光产物之前只具有短波长发射，因此可以对酶活性进行灵敏检测（第 10 章—酶底物和检测）。

最常见的外源性淬灭剂是顺磁物质（如 O2 和碘化物等重原子），它们以浓度依赖性方式降低荧光量子产率。如果淬灭是由碰撞相互作用引起，通常情况下，可得出荧光基团和淬灭剂接近程度以及相互扩散率的信息。这种淬灭效应已有效用于测量细胞中的氯离子通量（第 21.2 节—检测氯化物，磷酸盐，亚硝酸盐和其他阴离子）。许多荧光基团也被蛋白质淬灭。例如 Alexa Fluor、荧光素和 BODIPY 染料，其影响明显是由于与芳香族氨基酸残基的电荷转移相互作用所致。 因此，针对这些荧光基团的抗体是有效，且具有高度特异性的荧光淬灭剂  （第 7.4 节—抗染料和抗半抗原抗体）。

具有较强 pH 值依赖性吸收和荧光特性的荧光基团，如 BCECF 和羧基 SNARF -1 可用作生理 pH 值指示剂。荧光素和羟基香豆素（伞形酮）是这种类型荧光基团的进一步示例。在结构上， pH 值灵敏度是由于质子化时发生的荧光基团 π - 电子系统的重新配置所致。BODIPY FL 和 Alexa Fluor 488 荧光基团（这两个荧光基团均缺乏蛋白可电离取代基团），为需要使用 pH-in敏感探针的应用提供了荧光素的光谱相似的替代品（第 1.3 节—覆盖可见光谱和红外光谱的 Alexa Fluor 染料， 第 1.4 节—BODIPY 染料系列）。

前面的讨论介绍了选择荧光探针时需要考虑的一些一般原则。具体应用的详细信息见 《分子探针手册》的后续章节。关于荧光技术的深度处理及其生物学应用，读者可参考下列众多优秀书籍和评论文章。

荧光检测的原理

• Albani, J.R., Absorption et Fluorescence: principes et Applications, Lavoisier (2001).这本书是第一本用法语出版有关吸收和荧光的书籍。
• Albani, J.R., Principles and Applications of Fluorescence Spectroscopy, Wiley-Blackwell (2007).
• Brand, L. and Johnson, M.L., Eds., Fluorescence Spectroscopy (Methods in Enzymology, Volume 450), Academic Press (2008).
• Gell, C., Brockwell, D. and Smith, A., Handbook of Single Molecule Fluorescence Spectroscopy, Oxford University Press (2006).
• Goldys, E.M., Ed., Fluorescence Applications in Biotechnology and Life Sciences, Wiley-Blackwell (2009).
• Guilbault, G.G., Ed., Practical Fluorescence, Second Edition, Marcel Dekker (1990).
• Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C. and Ha, T., “Advances in single-molecule fluorescence methods for molecular biology,” Annu Rev Biochem (2008) 77:51–76.
• Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition, Springer (2006).
• Mathies, R.A., Peck, K. and Stryer, L., "Optimization of high-sensitivity fluorescence detection," Anal Chem (1990) 62:1786–1791.
• Royer, C.A., "Approaches to teaching fluorescence spectroscopy," Biophys J (1995) 68:1191–1195.
• Selvin, P.R. and Ha, T., Eds., Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2007).
• Valeur, B., Molecular Fluorescence: Principles and Applications, John Wiley and Sons (2002).

荧光基团和荧光探针

• Berlman, I.B., Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, Second Edition, Academic Press (1971).
• Burry， R.W. Immunocytochemistry: A Practical Guide for Biomedical Research, Springer (2009).
• Chalfie, M. and Kain, S.R., Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols, Second Edition, John Wiley and Sons (2006).
• Drexhage, K.H., "Structure and properties of laser dyes" in Dye Lasers, Third Edition, F.P.Schäfer Ed. ， Springer-Verlag,(1990) pp. 155-200.
• Green, F.J., The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators, Aldrich Chemical Company (1990).
• Griffiths, J., Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press (1976).
• Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Second Edition, Academic Press (2008).
• Hilderbrand, S.A., “Labels and probes for live cell imaging: Overview and selection guide”, Methods Mol Biol (2010) 581:17–45.
• Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P.L. and Urano, Y., “New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging,” Chem Rev (2010) 110:2620–2640.
• Kricka, L.J. and Fortina, P., “Analytical ancestry: "Firsts" in fluorescent labeling of nucleosides, nucleotides, and nucleic acids,” Clin Chem (2009) 55:670–683.
• Liehr, T., Ed., Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Application Guide, Springer (2008).
• Mason, W.T., Ed., Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Second Edition, Academic Press (1999).
• Oliver, C. and Jamur, M.C., Eds., Immunocytochemical Methods and Protocols, Third Edition (Methods in Molecular Biology, Volume 588), Humana Press (2010).
• Taraska, J.W. and Zagotta, W.N., “Fluorescence applications in molecular neurobiology”, Neuron (2010) 66:170–189.

荧光显微镜检测

• Frigault, M.M., Lacoste, J., Swift, J.L. and Brown, C.M., “Live-cell microscopy: Tips and tools,” J Cell Sci (2009) 122:753–767.
• Fujimoto, J.G. and Farkas, D., Eds., Biomedical Optical Imaging, Oxford University Press (2009).
• Goldman, R.D., Swedlow, J.R. and Spector, D.L., Eds., Live Cell Imaging: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2009).
• Hell, S.W., “Microscopy and its focal switch,” Nat Methods (2009) 6:24–32.
• Herman, B., Fluorescence Microscopy, Second Edition, BIOS Scientific Publishers (1998).
• Hibbs, A.R., Confocal Microscopy for Biologists, Springer (2004).
• Huang, B., Bates, M. and Zhuang, X., “Super-resolution fluorescence microscopy,” Annu Rev Biochem (2009) 78:993–1016.
• Inoué, S. and Spring, K.R., Video Microscopy, Second Edition, Plenum Publishing (1997).
• Lichtman, J.W. and Conchello, J.A., “Fluorescence microscopy,” Nat Methods (2005) 2:910–919.
• Masters, B.R., Confocal Microscopy and Multiphoton Excitation Microscopy: The Genesis of Live Cell Imaging, SPIE Press (2006).
• Matsumoto, B., Ed., Cell Biological Applications of Confocal Microscopy, Second Edition (Methods in Cell Biology, Volume 70), Academic Press (2003).
• Murphy, D.B., Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, John Wiley and Sons (2001).
• Ntziachristos, V., "Fluorescence molecular imaging," Annu Rev Biomed Eng (2006) 8:1–32.
• Patterson, G., Davidson, M., Manley, S. and Lippincott-Schwartz, J., “Superresolution imaging using single-molecule localization,” Annu Rev Phys Chem (2010) 61:345–367.
• Pawley, J.B., Ed., Handbook of Biological Confocal Microscopy, Third Edition, Springer (2006).
• Periasamy, A., Ed., Methods in Cellular Imaging, Oxford University Press (2001).
• Rosenthal, E. and Zinn, K.R., Eds., Optical Imaging of Cancer: Clinical Applications， Springer (2009)。
• Spector, D.L. and Goldman, R.D., Basic Methods in Microscopy, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2005).
• Svoboda, K. and Yasuda, R., “Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience,” Neuron (2006) 50:823–839.
• Tsien, R.Y., " Imagining imaging's future," Nat Rev Mol Cell Biol (2003) 4:SS16–SS21.
• Yuste, R. and Konnerth, A., Eds., Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2005).

流式细胞分析

• Darzynkiewicz, Z., Crissman, H.A. and Robinson, J.P., Eds., Cytometry, Third Edition Parts A and B (Methods in Cell Biology, Volumes 63 and 64), Academic Press (2001).
• Givan, A.L., Flow Cytometry: First Principles, Second Edition, John Wiley and Sons (2001).
• Herzenberg, L.A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M. and Herzenberg, L.A., "The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: A view from Stanford," Clin Chem (2002) 48:1819–1827.
• Herzenberg, L.A., Tung, J., Moore, W.A., Herzenberg, L.A. and Parks, D.R., “Interpreting flow cytometry data: A guide for the perplexed,” Nat Immunol (2006) 7:681–685.
• Preffer F. and Dombkowski, D. “Advances in complex multiparameter flow cytometry technology: Applications in stem cell research,” Cytometry B (2009) 76:295–314.
• Shapiro, H.M., "Optical measurement in cytometry: Light scattering, extinction, absorption and fluorescence," Meth Cell Biol (2001) 63:107–129.
• Shapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, Fourth Edition, Wiley-Liss (2003).
• Sklar, L.A., Ed., Flow Cytometry for Biotechnology, Oxford University Press (2005).

其他荧光测量技术

• Dorak, M.T., Ed., Real-Time PCR, Taylor and Francis (2006).
• Gore, M., Ed., Spectrophotometry and Spectrofluorimetry: A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (2000).
• Mardis, E.R.“Next-generation DNA sequencing methods,” Annu Rev Genomics Hum Genet (2008) 9:387–402.
• Patton, W.F., "A thousand points of light: The application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics," Electrophoresis (2000) 21:1123–1144.
• Shimomura, O., Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, World Scientific Publishing (2006).