核酸标记方法

核酸探针可以在合成过程中用标签或其他修饰标记。但是，取决于修饰程度以及是否需要昂贵的纯化服务，购买定制寡核苷酸探针（尤其是 RNA）可能会非常昂贵。此外，修饰寡核苷酸的最低订购量通常比未修饰版本高得多，并且与预期应用所需的量相比可能过多。因此，许多研究人员可能会选择内部方法或标记试剂盒用于探针生成。

许多试剂可用于快速、高效地进行台式寡核苷酸标记，最适合于制备少量探针或需要使用相同标签的多种不同探针（即进行突变分析）。对于小规模探针生成需求，酶法是一种经济的标记探针方法。相比之下，化学方法适用于较大规模的反应。有酶法和化学方法可用于创建在寡核苷酸的 5′ 或 3′ 端标记的探针以及随机掺入到整个序列中的探针。所需方法的选择部分取决于所需的标记程度以及修饰是否会引起阻碍所需相互作用的空间位阻。通常，核酸杂交反应（即 Northern 印迹）得益于通过将标记随机掺入探针而获得的高比活度。然而，需要蛋白相互作用的检测（即凝胶迁移和沉降测定）需要末端标记以允许蛋白结合。

末端脱氧核苷转移酶 (TdT) 是一种在某些淋巴细胞群中表达的 DNA 聚合酶。TdT 通常向 DNA 链的 3′ 末端添加大量脱氧核苷酸，但可优化反应条件，从而仅发生 1 – 3 个掺入事件。TdT 不依赖模板，且不受 DNA 序列的显著影响，但 DNA 结构很重要。TdT 对单链 DNA 的 3′ 末端具有较高的活性，但也可以较低的效率修饰双链 DNA 的 3′ 突出端。TdT 对平末端或 5′ 突出端的双链 DNA 具有较差的活性。TdT 修饰的 DNA 模板的常见来源包括未标记的单链 PCR 引物和具有 3′ 突出端（"粘性末端"，5′ 凹陷端）的双链限制性核酸内切酶片段。

TdT 通常用于标记 RACE（cDNA 末端快速扩增）检测的 DNA 探针和 TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记）检测，以及作为一种向 DNA 片段中添加 3′ 突出端以促进克隆的方法。TdT 还可用于使用放射性和非放射性标签标记标记 DNA 探针的 3′ 端，以进行各种检测和亲和应用。例如，向互补 DNA 探针的 3′ 末端加入生物素 -11 UTP 是创建用于非放射性电泳迁移率变动实验 (EMSA) 和 DNA 沉降实验的探针的有效方法。下图显示了几种不同修饰核苷酸的 TdT 掺入比较。

修饰核苷酸的 TdT 掺入。将 30 单位 TdT 与 48 bp 寡核苷酸以及修饰核苷酸与其他三种核苷酸的等摩尔混合物在室温下孵育 4 小时。使用 Invitrogen SYBR Gold 核酸凝胶染色剂染色的 20% TBE 预制凝胶对反应产物进行分析。比较了不同修饰核苷酸的 TdT 掺入。

T4 RNA 连接酶是编码 T4 噬菌体基因组的一种酶。T4 RNA 连接酶催化末端 5′-磷酸与 RNA 末端 3′-羟基的连接。T4 RNA 连接酶不依赖模板，但需要单链 RNA 和 ATP。虽然 T4 RNA 连接酶的主要底物是 RNA，但可以针对单链 DNA 分子优化反应条件；然而效率很低。

T4 RNA 连接酶用于将 RNA 的 3′ 端标记有 [5′ ³²P]pCp（胞苷-3',5'-双磷酸盐），修饰 mRNA 以生成 cDNA 文库并进行 5′-RACE。T4 RNA 连接酶也可使用适当修饰的核苷 3',5'-二磷酸将非放射性标签标记在 3' 端 RNA 上。

使用 T4 RNA 连接酶标记 RNA 3′ 端的化学过程。

T4 多聚核苷酸激酶 (T4 PNK) 是编码 T4 噬菌体基因组的一种酶。T4 PNK 将有机磷酸盐从 ATP 的 γ 位置转移至 DNA 和 RNA 的 5′-羟基。野生型酶也具有 3′- 磷酸酶活性。T4 PNK 连接酶不依赖模板，可高效修饰单链多核苷酸和 5′ 突出端。可以对平末端和 5′ 凹陷端进行修饰，但效率会降低。

T4 PNK 主要用于用同位素修饰 ATP 的放射性磷酸盐标记多核苷酸的 5′ 末端。与 TdT 或 T4 RNA 连接酶相比，PNK 在修饰短突出端和平末端片段时更高效。虽然可以进行磷酸盐交换反应，但当靶分子的 5′ 末端去磷酸化时，PNK 标记最高效。PNK 的另一种常见用途是对合成多核苷酸（即 DNA 引物）进行 5′ 磷酸化以促进克隆。Invitrogen KinaseMax 5' 末端标记试剂盒可使用 T4 多核苷酸激酶和 [γ-³²P] ATP 对 DNA 或 RNA 进行高效末端标记，以获得高比活性，或使用未标记的 ATP 对 5' 末端进行定量磷酸化。该试剂盒包含足够进行 30 次反应的试剂。

与 T4 PNK 进行 5’ 末端标记反应。比较使用标准和 KinaseMax 正向反应缓冲液对 24 聚体 DNA 和 18 聚体 RNA 寡核苷酸进行 5’ 末端标记反应。使用 10 单位 T4 多聚核苷酸激酶、25 pmol [γ-32P] ATP 和正向反应缓冲液在 10 ul 反应中标记 DNA 和 RNA 寡核苷酸。使用该试剂盒可获得更高的标记寡核苷酸得率。

DNA 聚合酶是一类酶，可通过将脱氧核糖核苷酸（单体）的 5′-磷酸化末端与现有 DNA 链（DNA 延伸）或引物（引物延伸）的 3′-羟基末端结合，生成脱氧核糖核酸聚合物。DNA 聚合酶依赖模板，但不依赖于序列。要合成 DNA，必须对现有 DNA 链的 3′-OH 末端退火至 DNA 互补链。病毒逆转录酶是该规则的例外，它使用 DNA 或 RNA 引物和 RNA 模板合成互补 DNA。DNA 聚合酶将通过现有的 3′-OH 末端合成新的 DNA 链，添加与正在读取的模板链互补的单个核苷酸。DNA 聚合酶用于从克隆到测序的多种实验室用途。需要扩增 DNA 特定片段的应用是借助使用聚合酶链反应 (PCR) 从嗜热微生物（例如 水生栖热菌  (Taq)、 嗜热脂肪芽孢杆菌  (Bst)、 嗜热球菌  (Vent)）克隆的热稳定酶进行的应用。对于不需要扩增的应用，可使用来自嗜温微生物（例如 大肠杆菌  (Klenow) 和噬菌体 (T4, T7)）的 DNA 聚合酶，具体取决于合成的 DNA 长度和所需的复制保真度。

在 DNA 聚合酶的帮助下产生的探针通常是通过在 DNA 复制过程中随机掺入修饰的核苷酸而制成，这可以通过 PCR 或简单的引物延伸反应完成。以这种方式生成的探针具有较高的比活度，可检测少量靶标。传统上，该方法需要放射性核苷酸以生成探针；但是，如果修饰不干扰聚合酶延伸反应（终止子测序应用除外），则可使用生物素、荧光基团和其他非放射性标签。对于需要较低比活度的应用或需要靶向标记时，DNA 聚合酶可用于特异性标记 DNA 探针末端。为了标记 DNA 探针的 5′ 末端，必须使用 5′ 末端修饰的引物。当向太长而无法进行有效自动合成的 DNA 探针添加亲和标签或荧光团时，此方法特别有用。此方法非常适用于通过 PCR 或简单的引物延伸反应进行 5′ 末端标记。

为在 3′ 端或附近标记 DNA 探针，可以使用 DNA 聚合酶将一个或多个修饰的核苷酸掺入具有凹陷 3′ 端的双链探针末端。这种"填充"反应可以用交错退火的引物、限制性片段或任何其他双链 DNA 分子进行，其中互补 DNA 序列可退火并用作 3′ 末端延伸的模板。Klenow 片段（大肠杆菌  DNA 聚合酶 I）通常用于填充反应，当与产生 3′  凹陷末端的 DNA 引物杂交时，甚至可用于 3′ 末端标记 RNA 分子。

使用 Klenow 片段对生物素标记的 DNA 进行斑点印迹分析。Thermo Scientific Biotin DecaLabel DNA 标记试剂盒（包括 Klenow 片段、exo-）用于生物素标记 Lambda DNA/HindIII 片段。然后将生物素标记的 DNA 用作杂交探针，用于 SensiBlot Plus 尼龙膜上的同源 DNA 斑点印迹，并用 Thermo Scientific 生物素显色检测试剂盒进行显影。由于存在 Klenow 片段、exo-，使用该试剂盒可以获得高产率的生物素标记 DNA。

RNA 聚合酶是一类酶，通过催化核糖核苷酸（单体）的 5′-磷酸化末端与先前掺入的核糖核苷酸的 3′-羟基末端结合来生成核糖核酸聚合物。RNA 聚合酶依赖模板和序列依赖性，需要模板 DNA 内的启动子序列来启动酶的结合，根据宿主系统，RNA 转录在单链模板上进行需要各种辅助因子。

RNA 聚合酶用于多种实验室用途，从 mRNA 体外合成到生成用于杂交和结合分析的探针。在 RNA 聚合酶的帮助下产生的探针是通过在转录过程中随机掺入修饰的核苷酸制成。这通常通过将 cDNA 或其他模板序列克隆到含有一个或多个 RNA 聚合酶启动子序列的质粒中来完成。以这种方式生成的 RNA 探针具有较高的比活度，最常使用放射性核苷酸制成，但也可使用生物素和其他标签。Thermo Scientific 噬菌体 T7 RNA 聚合酶是一种 DNA 依赖性 RNA 聚合酶，对其相应的双链启动子具有严格特异性。它催化启动子下游单链 DNA 或双链 DNA 上 RNA 的 5' 到 3' 合成。

T7 RNA 聚合酶启动子序列。带有该启动子序列的线性 DNA 模板可与 T7 RNA 聚合酶一起用于体外转录标记的 RNA 探针。+1 位置表示转录过程中第一个掺入 RNA 的核苷酸。+1 至 +3 位置上的碱基对于转录至关重要，并且必须分别是 G 和 2 个嘌呤碱基。使用具有该启动子序列的 T7 RNA 聚合酶可以产生标记的 RNA 探针。

亚高碘酸盐和 正高碘酸盐（分别为 IO₄  和 IO₆）是由碘和氧形成的阴离子，通常以钾盐（例如 KIO₄）或钠盐（例如 NaIO₄）的形式存在。在溶液中，高碘酸盐会断裂具有羟基（邻位二醇或 顺式乙二醇）的相邻碳原子之间的键，从而产生两个醛基。所产生的醛基自发与含有伯胺的分子和表面发生反应。醛可与伯胺或酰肼活化标签发生两种类型的偶联反应。伯胺与醛反应形成席夫碱，该物质很容易水解，且必须通过与氰基硼氢化钠 (NaBH₄) 还原为仲胺键来保持稳定。酰肼修饰分子也会自发与醛发生反应，但形成非常稳定的腙键，使反应更高效。添加氰基硼氢化钠将可进一步提高反应效率，并随着时间的推移和 pH 值变化提高键稳定性。

由于其具有温和的氧化特性， 高碘酸钠通常被用作蛋白碳水化合物的氧化剂，以生成用于检测或化学偶联程序的反应性醛基。RNA 核苷酸中核糖的邻二醇也可以用高碘酸盐切割，因此这种方法可用于在 RNA 而不是 DNA 上添加单个 3′ 末端标签。

通过高碘酸钠切割 RNA。

碳二亚胺是一种功能团 (RN=C=NR)，通常用于有机合成，以活化伯胺 (RNH₂) 和含羧酸盐 (RCOOR′) 或磷酸盐 (R-PO₄) 的分子之间酰胺或亚磷酰胺键的形成。与大多数交联剂不同，碳二亚胺不会成为分子之间最终交联的一部分，因此不会向所得产物添加任何额外的化学结构。EDC（EDAC，1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基] 碳二亚胺盐酸盐）是一种水溶性碳二亚胺，适用于 pH 值在 4.0 至 6.0 范围内的水性反应，其反应副产物可以通过透析或沉淀偶联产物轻松去除。

在与羧酸基团的反应中，EDC 形成活性  O-酰基异脲中间体，该中间体很容易被反应混合物中的伯氨基亲核攻击置换。可以用磷酸盐（即寡核苷酸的 5' 磷酸盐）进行相同的反应，尽管必须在反应中加入咪唑才能实现高效偶联。由于需要 5′ 磷酸，因此必须首先用激酶处理合成的寡核苷酸。除了这个小的例外，EDC 介导的偶联是将 RNA 和 DNA 偶联到几乎任何其他含伯胺分子或表面的经济方法。

5′磷酸盐被 EDC 和咪唑活化。

可通过各种方法实现核酸的随机化学标记。由于这些方法沿 DNA 或 RNA 分子长度的随机位点进行标记，因此可以实现比末端标记技术更高的标记程度。然而，这些方法的缺点之一是核苷酸碱基被直接修饰，这将在杂交实验过程中减少或防止互补链之间的碱基对。因此，在某些实验中，可能需要平衡标记程度和探针的杂交效率。

最常用的化学随机标记策略包括使用光反应性标记试剂或通用键系统 (ULS, KREATECH Biotechnology B.V.)。两种光反应性标记试剂用于核酸：基于苯基叠氮化物和补骨脂素。当苯叠氮化物官能团暴露于紫外光下时，它形成了一种不稳定的氮烯，可以通过添加反应非特异性地插入双键以及 C-H 和 N-H 位点，前提是不存在更具反应性的亲核蛋白（例如伯胺）。含有补骨脂素官能团的分子可用于标记双链 DNA 或 RNA。补骨脂素环结构可有效地嵌入双链部分，暴露于紫外光下会导致胸腺嘧啶残基中的 5,6-双键形成环加成产物。ULS 标记试剂含有专有的温度活化铂基团，其与 RNA 和 DNA 以及蛋白的蛋氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基的侧链中的鸟嘌呤碱基发生反应。

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