细胞裂解和蛋白提取概述

所有细胞都有一个质膜，这是一种蛋白 - 脂质双分子层，可形成从细胞外环境中分离细胞内容物的屏障。组成质膜的脂质为两亲性，具有亲水性和疏水性基团，它们自发结合以形成封闭的双分子片。膜蛋白包埋在脂质双分子层中，由一个或多个跨疏水核心的结构域固定到位。此外，外周蛋白通过与整合膜蛋白或极性脂质头基团的相互作用结合双分子层的内表面或外表面。脂质和蛋白质含量的性质因细胞类型和生物体物种而异。

细胞膜结构。由细胞外膜组成的脂质双分子层的图示。

在动物细胞中，质膜是将细胞内容物与环境分离的唯一屏障，但在植物和细菌中，质膜也被刚性细胞壁包围。细菌细胞壁由肽聚糖组成。酵母细胞壁由两层 ß - 葡聚糖组成，内部层不溶解于碱性条件下。这两种结构均为富含碳水化合物甘露聚糖的外糖蛋白层所环绕。植物单元壁由多层纤维素组成。这些类型的细胞外屏障赋予细胞形状和刚性。植物细胞壁非常结实，因此很难破坏机械或化学结构。直到最近，酵母细胞的高效裂解需要使用玻璃微珠进行机械破碎，而细菌细胞壁则是最容易破坏的细胞类型。动物细胞中缺乏细胞外壁，因此相对容易裂解。

蛋白样品制备没有通用方案。样品制备方案必须考虑多种因素，例如样品类型的来源，蛋白质的化学和结构异质性，目标蛋白质的细胞或亚细胞位置，所需蛋白质产量 (取决于下游应用) 以及提议的下游应用。例如，尿液或血浆等体液已经是更均匀或更低且酶活性低的蛋白溶液，只需进行少量操作即可从这些样品中获得蛋白。但是，组织样品需要进行广泛的操作来破坏组织结构，控制酶活性并溶解蛋白。

 例如，功能性酶联免疫吸附测定 (ELISA) 或晶体学等应用不仅需要完整的蛋白质，还需要具有功能活性或保留 3D 结构的蛋白质。

用于样品收集的蛋白质来源示例。蛋白质可能来自许多来源，包括：天然来源，如哺乳动物细胞培养物，组织或体液；在模型系统 (如细菌，酵母菌，昆虫或哺乳动物细胞) 中过表达；杂交瘤细胞单克隆抗体；或用于农业生物技术的植物细胞。

从历史上看，物理裂解是细胞破碎和细胞内容物提取的首选方法；然而，它通常需要昂贵，繁琐的设备，并涉及由于仪器上的变异而可能难以重复的方案 (例如与紧密拟合的均质研杵相比的松动)。此外，传统的物理破碎方法也不适用于现代实验室研究中典型的高通量和较小体积。

细胞或组织破坏方法。许多细胞裂解方法已被开发出来，以获得不同种类的生物体、样品类型（细胞或组织）和靶分子或亚细胞结构的最佳产量和纯度。细胞裂解方法可分为两大类，试剂法和物理破碎法。

近年来，基于去垢剂的裂解方法已经成为常规方法。通过基于试验和误差的经验检测，开发了由特定类型和浓度的去垢剂溶液，缓冲液，盐和还原剂组成的不同去垢剂溶液，以针对特定物种和细胞类型提供最佳结果。去垢剂兼具裂解和增溶作用。

高质量蛋白质样品的分离是成功完成下游应用的基石。

通过仔细优化物理破碎技术，去垢剂缓冲液和密度梯度方法，开发了各种程序来分离亚细胞结构或化合物类别。例如，使用适当的去污剂，可以溶解疏水性膜蛋白并将其与亲水性蛋白分离。工具和步骤的组合能够分离完整细胞核，线粒体和其他细胞器，以用于研究或蛋白溶解。

细胞内的细胞核，线粒体和其他细胞器。

细胞裂解会扰乱受严格控制的细胞环境，从而使内源性蛋白酶和磷酸酶无法调控。因此，提取的蛋白质被这些分子的活性降解或事实上的修饰。

为了防止这些效应并在细胞裂解中获得最佳蛋白得率，需要向裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。已鉴别出许多化合物，并通过与蛋白酶和磷酸酶的可逆或不可逆结合来灭活或阻断蛋白酶和磷酸酶的活性。

在添加或不添加磷酸酶抑制剂的情况下提取蛋白，通过蛋白免疫印迹法检测提取物中总蛋白与磷酸化蛋白的相对水平。在使用 Thermo Scientific Pierce 磷酸酶抑制剂片剂或其他市售磷酸酶抑制剂片剂处理后，在小鼠脑提取物中测定蛋白对酸和碱性磷酸酶活性的抑制程度。图片显示了抑制百分比。

当细胞裂解的目的是纯化或测试特定蛋白的功能时，必须特别注意裂解试剂对目标蛋白的稳定性和功能的影响。某些去垢剂会使特定酶的功能失活，提取 / 纯化蛋白的长期稳定性通常需要将其从初始裂解试剂中去除和 / 或通过添加特定化合物进行稳定。

一些细胞裂解和蛋白溶解方法会导致蛋白变性。使用这种蛋白质进行功能测试需要它们重新成熟。当通过透析去除变性增溶试剂时，许多蛋白会自发重折叠成其天然功能结构。然而，其他蛋白质将通过该过程折叠成非功能性，甚至不溶性形式。在这种情况下，必须检测专用的缓冲条件，以确定那些能够促进较高可能得到正确复性蛋白得率的缓冲液条件。

使用 Pierce 蛋白质复性试剂盒检测复性溶菌酶的结果。每种缓冲液均含有指示变性剂和氧化还原浓度以及 50 mM Tris ， 18 mM NaCl ， 8 mM KCl ， 1 mM EDTA ； pH 值 8.2。 恢复以重折叠后活性最高的试验 (缓冲液 7) 的百分比报告。与非变性对照品相比，试验 7 代表超过 90% 的溶解溶菌酶复性。(聚乙二醇 (PEG) ；二硫苏糖醇 (DTT) ；还原谷胱甘肽 (GSH) ；氧化谷胱甘肽 (GSSG))。

1. Walker JM (2009) The Protein Protocols Handbook.第 3 版.纽约（NY）：Springer-Verlag New York, LLC.
2. Vallejo FL, Rinas U (2004) Strategies for recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins.Microb Cell Fact 2:3(1):11.