RNA 干扰 (RNAi) 是用于研究细胞基础生物学的强有力工具，可通过基因表达敲低来研究各种细胞类型中的蛋白功能。人们曾将 RNAi 视为仅在选定实验室使用的技术，而 RNAi 现已成为研究基因功能的必需技术。RNAi 已成为用于蛋白敲低研究、表现型分析、功能恢复、通路分析、体内敲低和药物靶点发现的重要工具。

常见 RNAi 术语表

RNAi

核糖核酸干扰（A. Fire 和 C. Mello 等人, 1998）。

siRNA

短干扰 RNA。siRNA 是具有 21 – 25 碱基对的 dsRNA，且带有双核苷酸的 3'突出段，在 RNA 干扰通路中由 Dicer 从较长的 dsRNA 加工而来。通过引入合成的 siRNA，可以在哺乳动物细胞中诱导 RNAi。siRNA 也可来自内源性前体细胞。

shRNA

短发夹 RNA；也称为短干扰发夹。shRNA 用于在基于载体的方法中为细胞提供 siRNA，以实现稳定的基因沉默。采用 Pol III 型强启动子驱动靶序列转录，形成长度可变的发夹和茎环，然后通过细胞的 siRNA 机制进行处理。shRNA 进入细胞后，可以通过 RNAi 下调具有互补序列的基因表达。

miR RNAi

表达小分子 RNA 的载体，可用于 RNAi。小分子 RNA 是长度为 19 – 23 个核苷酸的单链 RNA，其单链前体转录本含有碱基不完全配对的发夹结构。miRNA 在沉默复合物中的功能即使与 RISC 不完全相同，但也类似（参见下文）。

经化学修饰的 siRNA

经过化学修饰的 siRNA 分子。

RISC

RNA 诱导沉默复合物 (RISC)。由蛋白质和dsRNA 组成的核酸酶复合物，可以靶向并切割 RISC 复合物中与 siRNA 互补的内源性 mRNA。

脱靶效应

在导入 siRNA 或 d-siRNA 库后，如果一个或几个未特异性靶定的基因表现出基因功能缺失，即为脱靶效应。该效应可能由 siRNA 的有义链介导，可能导致启动无关基因的功能丧失反应。如果脱靶效应具有足够的同源性从而可敲低非靶基因的表达，则脱靶效应也可作为特异性 siRNA 反义链的继发效应发生。

RNAi 的工作原理

有两类小 RNA 分子在 RNAi 中发挥功能。第一类是合成的短干扰 RNA (siRNA) 分子，它们可以靶向 mRNA 切割，可有效敲低目标基因的表达。第二类是小分子 RNA (miRNA) 分子，它们是天然存在的单链 RNA，长度为 19 – 22 个核苷酸，通过结合靶标 mRNA 的 3'非翻译区 (UTR) 并抑制翻译，从而调节基因表达（Ambros，2004）。

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siRNA 分析

有多种诱导 RNAi 的方式：合成分子、RNAi 载体和体外切割（下文图 1）。在哺乳动物细胞中，dsRNA 的短片段（即短干扰 RNA）可以启动靶细胞 mRNA 的特异性降解。在此过程中，siRNA 的反义链成为多蛋白复合物或 RNA 诱导沉默复合物 (RISC) 的一部分，然后可识别相应的 mRNA，并在特定位点进行切割。随后，这条经过切割的信使被靶向降解，最终导致蛋白表达缺失。

siRNA Analysis image

图 1：哺乳动物细胞中的 RNAi 敲低方法。

miRNA 分析

RNA 聚合酶 II 和 III 均转录含有 miRNA 的基因，生成较长的初级转录本 (pri-miRNA)，该转录本通过 RNase III 型 Drosha 酶的加工，可以获得长度为 70 – 90 碱基对的发夹结构 (pre-miRNA)。Pre-miRNA 发夹会转移至细胞质，在 RNase III Dicer 蛋白的作用下进一步加工为短双链体 miRNA，长度为 19 – 22 个核苷酸。miRNA 双链体由 RNA 诱导沉默复合物 (RISC) 识别，RISC 是一种多蛋白核酸酶复合物，且两条链的其中一条（即引导链）可以帮助该蛋白复合物识别其同源 mRNA 转录本。RISC-miRNA 复合物通常与序列同源性不佳区域中靶标 mRNA 的 3' UTR 相互作用，从而抑制蛋白质合成，但具体机制尚未完全阐明（下文图 2）。

植物 miRNA 可以通过精确或几乎精确的互补碱基配对与靶标 mRNA 序列结合，从而直接切割并破坏 mRNA（Rhoades 等人，2002；Chen，2005）。与 RNA 干扰 (RNAi) 中发生的机制类似，靶标 mRNA 上单磷酸二酯键的切割发生于第 10 个和第 11 个碱基之间（Elbashir 等人，2001）。不过，迄今为止，几乎所有研究动物的 miRNA 都未与其 mRNA 靶标完美互补，并似乎会在抑制蛋白质合成的同时维持 mRNA 靶标的稳定性（Ambros，2004）。研究表明，转录本可能受多个 miRNA 调控，单个 miRNA 可能靶向多个转录本。研究显示，多达三分之一的人类基因可能受 miRNA 调控（Lim 等人，2003）。尽管已经在各种生物体中发现了数以百计的 miRNA，但人们对其细胞功能仍知之甚少。miRNA 具有体积小、缺乏多聚腺苷酸尾以及易与序列同源性不佳的 mRNA 靶标结合等独特物理属性，导致对它们的研究变得难以捉摸和具有挑战性。

miRNA Analysis image

图2：miRNA 的生物发生和功能。小分子 RNA 转录本由 RNA 聚合酶 II 和 III 生成，经 RNase III 酶 Drosha（细胞核）和 Dicer（细胞质）处理后，获得长度为 19 – 22 个核苷酸的 miRNA 双链体。双链体的其中一条链参与形成 RISC 复合物，该复合物调控蛋白表达。

选择和 RNAi 方法

RNAi（RNA 干扰）过程可通过 siRNA 或 miRNA 调控。这两种 RNA 均由 Dicer 酶在细胞内完成加工，并形成 RISC 复合物（RNA 诱导沉默复合物）。但是，两者之间存在微妙差异。

siRNA 是外源性双链 RNA，可以经化学合成后直接转染至细胞内，或者将表达短发夹 RNA (shRNA) 的载体导入细胞后在细胞内生成，其中，短发夹 RNA 是 siRNA 的前体分子。另一方面，miRNA 为单链 RNA，来源于较大 RNA 分子上内含子中的内源性非编码 RNA。然而，shRNA 形成功能性 siRNA 的加工涉及与天然加工基因组编码的 miRNA 相同的细胞内 RNAi 机制，而 miRNA 通过调节 mRNA 稳定性、翻译和染色质结构进行细胞基因表达调控（Hutvagner 和 Zamore，2002）。

siRNA 和 miRNA 之间的另一差异在于，siRNA 在动物体内一般可与 mRNA 靶标实现完全匹配和特异性结合，而 miRNA 由于无法实现完全配对，可抑制多种不同 mRNA 序列的翻译。在植物中，miRNA 往往具有更匹配的互补序列，从而诱导 mRNA 切割，而不仅仅是抑制翻译。

siRNA 和 miRNA 均可通过 RNA 诱导的转录沉默 (RITS) 过程，在表观遗传学方面发挥作用。同样，鉴于它们在基因表达调控方面的作用，二者也都是重要的治疗靶标。

 siRNAmiRNA
来源天然存在于植物和低等动物中。但目前尚不清楚是否天然存在于哺乳动物体内。天然存在于植物和动物中。
构造双链单链
长度21 – 22 个核苷酸19 – 25 个核苷酸
与靶标 mRNA 的互补性100% 完全匹配；因此，siRNA 可以敲低特异性基因，预期几乎无脱靶现象。不精确；因此，单个 miRNA 可靶向多达数百种 mRNA。
生物发生调控表达其自身的相同基因。由生成 miRNA 的基因表达，但调控的基因 (mRNA) 并非只有表达 miRNA 的基因。
措施切割 mRNA抑制 mRNA 翻译
功能在无抗体或细胞介导免疫的动植物中发挥基因沉默保护功能。基因 (mRNA) 调控因子（抑制剂）
用途siRNA 作为敲低基因的重要工具，几乎每个分子生物学实验室都在使用。部分 siRNA 还作为潜在的治疗性制剂在临床试验中使用。其具有潜在的治疗用途，可用作药物靶标或药物制剂。miRNA 的表达水平可用作潜在的诊断工具和生物标记物。

* 表格摘自 Mack (2007)

仅供科研使用，不可用于诊断目的。