成功染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测和抗体选择的分步指南。

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介绍

表观遗传学研究基因表达中的遗传性变更，它们修饰 DNA、RNA 和蛋白质，但不改变核苷酸序列。调节表观遗传状态的一种常见机制是翻译后修饰 (PTM)。在许多蛋白质中，组蛋白家族的蛋白质易发生 PTM。组蛋白将基因组 DNA 包装到核小体中，从而能够将大约 2 米的 DNA 放入细胞的细胞核。核小体含有两个亚基，每个亚基由组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 组成。此外，还有组蛋白 H1，通常称为连接组蛋白。在组蛋白上发现的最普遍的 PTM 是甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化。

染色质免疫沉淀 (ChIP) 是研究表观遗传学的常用技术，因为它可使研究人员捕获蛋白质与DNA 特异性相互作用的快照。随着下一代测序 (NGS) 的出现，ChIP 已变得更强大——研究人员现在不仅可以获得几个结构域中蛋白质与 DNA 特异性相互作用的快照，还可以获得全基因组中这类相互作用的快照，方法是把纯化的 ChIP DNA 改成 NGS ，称为 ChIP 测序 (ChIP-Seq)。该快照是通过交联活细胞中的 DNA 和蛋白质，然后提取并剪切染色质来实现的。最后，样品与靶向目标蛋白的抗体进行免疫沉淀。DNA 是从蛋白质中提取的，可在基因组的特定区域通过定量 PCR (qPCR) 或通过 NGS 在全基因组范围内对其进行评估。 

在 ChIP 检测分析中，第二个重要考虑因素是抗体的特异性，因为非特异性抗体会影响结果的准确性，也会您准确理解靶标。尽管您希望您的抗体在所有应用中只识别受关注的靶标，但 ChIP 使该问题复杂化。例如，如果您想知道 H3K9me2 蛋白在基因组上的结合位置，您就需要确保仅拆毁二甲基 (ME2) 标记，而不是单甲基 (me1) 或三甲基 (ME3) 标记。H3K9me2 通常是抑制性标记，但 H3K9me1 通常是激活标记。因此，如果您使用的抗体也识别 H3K9me1，即使其识别 H3K9me1 的严格程度只有其识别 H3K9me2 的十分之一，则您生成的数据将会误导您对 H3K9me2（图 1）的理解。我们使用 ELISA 证明：我们的 H3K9me2 抗体 能够特异性识别二甲基标记。这表明了具有很高特异性的抗体对靶标的重要性。抗体的特异性越高，结果的可靠性和准确性将会越高。Thermo Fisher Scientific 提供 琼脂糖 和 磁珠  ChIP 试剂盒，包含大多数 ChIP 所需的试剂。

启动 ChIP 前还有几点注意事项： 

• 您提出的问题是什么？能通过查看比如 10 个位点来得到答案吗？或者您需要全基因组信息？ChIP-Seq 非常强大，但也需要大量生物信息学专业知识。如果您不确定，您可以从查看几个位点开始，然后如果全基因组信息有用，则选择创建 ChIP-Seq 文库。
• 对照对于 ChIP 至关重要。无论您是比较相同的细胞系还是不同的细胞系和处理，您所进行的每个 IP 都需要一个”无抗体对照品“(模拟 IP)。为了确定您的 ChIP 实验是否有效，需要考虑的其他对照品：
  • 知道应该在 IP 中富集并被 qPCR 扩增的 DNA 区域，以便显示 ChIP 有效（阳性对照） 
  • 了解您预期不会被富集从而预期不会通过 qPCR 扩增的 DNA 区域，以便显示 ChIP 具有特异性（阴性对照） 
• 对于标准方案，您需要约 2 x 10⁶ 个细胞/免疫沉淀。然而，近期出版物已经用少了几个数量级的细胞进行了 ChIP。

步骤 1：交联

染色质免疫沉淀（ChIP）检测分析始于蛋白质-DNA 复合物的共价稳定。许多蛋白质与 DNA 的相互作用是短暂的，且涉及多种蛋白质复合物来协调生物功能。由于蛋白质和 DNA 不断运动， ChIP 可捕获在特定时间内存在的蛋白质-DNA 复合物的快照。体内交联使蛋白质-DNA 复合物共价稳定。 

研究人员通常可使用交联剂组合来捕获正在相互作用的蛋白和 DNA。这些交联剂直接渗透到完整细胞中，并有效地将蛋白质-DNA 复合物锁在一起，即使是瞬态复合物也能被捕获并稳定下来进行分析。这些交联剂必须可逆，才能用于 ChIP。

传统上而且通常也都使用 甲醛溶液进行体内交联，无论是单独地还是联合使用其他交联剂（如 Thermo Scientific Pierce EGS (乙二醇双 (琥珀酰亚胺琥珀酸酯))或 DSG (双琥珀酰亚胺戊二酸酯))。甲醛 交联适用于直接相互作用的两个分子。然而，甲醛是一种零长度交联剂，限制了其功能性。对于更高阶相互作用，较长的交联剂如 EGS (16.1 Å) 或 DSG (7.7 Å) 可以捕获具有复杂四元结构的较大蛋白质复合物。对于某些组蛋白，可以使用天然 ChIP，因为蛋白质–DNA 相互作用 (例如 H3–DNA 和 H4–DNA) 本质上非常紧密，因此不需要交联。

交联提示： 

• 确定您需要的相互作用类型，以确定要使用的交联剂。 
• 交联步骤的持续时间很重要。太短可能导致交联效率低，太长可能导致染色质难以裂解和剪切成可用尺寸。确保淬灭交联反应，以确保您仅在所需时间内交联。

步骤 2：细胞裂解

在这一步骤中，细胞膜经基于去污剂的裂解液溶解，以释放细胞组分，并溶解交联蛋白-DNA 复合物。 

由于蛋白质和 DNA 的相互作用主要发生在核内，去除胞浆蛋白有助于减少背景信号和提高灵敏度。去垢剂或盐的存在不会影响蛋这些白质-DNA 复合物，因为第一步中的共价交联将使复合物在整个 ChIP 程序中保持稳定。蛋白酶及磷酸酶抑制剂(货号 88668 和 78440) 在本阶段对蛋白质–DNA 复合物保持完整至关重要。

尽管不建议采用机械裂解细胞，因为它可能导致细胞核裂解低效，但某些细胞类型难以通过任何其他方法裂解。Thermo Scientific Pierce 染色质制备模块 等试剂可从其他细胞组分中分离出细胞核组分。该模块用于消除背景信号并提高灵敏度。

细胞裂解提示： 

• 在显微镜下可观察到成功的细胞裂解。在裂解前后各采集 10 µL 样本，并使用血细胞计数器检查完整细胞与细胞核。 
• 细胞裂解程度可能因细胞类型而异。如果没有从细胞核中获得染色质，则需要更严苛的裂解。这可以通过增加在裂解缓冲液中的孵育时间、在裂解缓冲液中进行简短的超声处理或使用杜恩斯玻璃均质器来实现。 
• 如果您使用超声处理，将染色质始终保持在冰上，每次不会脉冲超过 30 秒，以确保蛋白质不会由于过度加热而变性。 

该提取步骤产生所有细胞核物质，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白-DNA 复合物。为了分析这些蛋白质结合序列，提取的基因组 DNA 必须被剪切成更小的可行片段。DNA 片段化通常通过超声以机械方式实现，或者通过 Thermo Scientific 微球菌核酸酶 (MNase)以酶消化方式实现。染色质的理想片段范围可以从 200 到 >700 bp；但是 DNA 剪切是最难控制的步骤之一。超声处理可提供真正随机的片段，但限制包括： 

• 对专用机械的要求，可能需要调整 
• 在超声处理过程中难以维持温度 
• 实操时间延长 
• 大量优化步骤 

使用 MNase 进行酶切具有高度可重现性，并且更适合处理多份样品。然而，酶切消化可能会导致酶活性变化所致的差异性。该酶对间核小体区域具有更高亲和力，随机较少。

染色质的剪切或酶切技巧：

• 如果这是您首次使用该细胞系，则确定一部分细胞的剪切或消化条件。为此，使用裂解的细胞并以不同数量的超声处理脉冲或 MNase 孵育时间运行一个时程。接下来，用盐和 Invitrogen 蛋白酶 K 溶液 在 65°C 下处理染色质、接着用 Invitrogen PureLink RNase A处理染色质来进行 DNA 分析。然后可以使用色谱柱或苯酚-氯仿提取纯化 DNA ，然后在琼脂糖凝胶上进行分析。随着时间的推移，您会看到 DNA 尺寸会减小；选择在 250 – 700 bp 范围内 DNA 量最大的时间点。 
• 无论您选择哪种方法缩短染色质片段，都要确认染色质长度处于每次实验的理想范围。
   

为了分离特异性修饰的组蛋白、转录因子或相关的辅助因子，使用经 ChIP 验证的抗体从其他核成分中免疫沉淀并分离出靶标。这一步骤有选择地富集了目标蛋白质-DNA 复合物，并消除了所有其他无关的细胞物质。

选择合适的抗体对成功进行 ChIP 检测分析很关键。有许多经验证 ChIP 的抗体可供选择。对于无法获得合格抗体的靶蛋白，与亲和标记物（例如 HA、Myc、His、T7、V5、或 GST）融合的蛋白都可在生物样品中表达，然后利用抗亲和标记物的抗体对靶标进行免疫沉淀。

抗体-蛋白质-DNA 复合物通过抗体结合树脂（如固定化蛋白 A、蛋白 G 或蛋白 A/G）亲和纯化。为了减少背景，首先用微珠孵育裂解物数小时后，再加入抗体，使裂解物预清除。每个 ChIP 样品中使用的磁珠体积也会影响背景，因为磁珠体积的增加会增加非特异性结合。

长时间孵育后，微珠-抗体-蛋白-DNA 复合物必须经过大量洗涤，通常接着使用低盐和高盐缓冲液依次纯化。然后洗脱蛋白质-DNA 复合物。 

微珠选择：

• 磁珠与琼脂糖珠—磁珠的优势在于易于分离，且可以轻松地在管中观察到磁珠，从而减少材料损失，获得高度可重现的结果。但是，琼脂糖微珠由于具有多孔性质，因此表面积更高，因此具有更高的结合能力。在大多数情况下，微珠的选择取决于研究人员的偏好。 
• 蛋白质 A 与蛋白质 G 相对于蛋白质 A/G 的关系—蛋白质 A/G 的组合是大多数实验室的理想选择。蛋白 A 对兔多克隆抗体具有极高亲和力，蛋白 G 对一系列抗体具有极好的亲和力。蛋白 A/G 结合了蛋白 A 和 G 的亲和力，而不降低抗体的亲和力

IP 技巧： 

• 抗体的选择非常重要。并非所有抗体都适用于 ChIP。当您的目标蛋白质与 DNA 交联时，抗体识别的抗原决定簇需要暴露而不是埋在蛋白质–DNA 复合物中。因此，理想情况下，您需要已经证实在 ChIP、IP 或其他应用中起作用的抗体。
• 每单位染色质使用的抗体量也在 ChIP 效率中发挥作用。抗体太少和太多都可能导致目标靶标的富集减少。 
• 加入微珠前，可节省约 5% 的样品。此部分将用作您的输入对照。 
• IP 之后的洗涤非常重要。洗涤不足可能导致非特异性信号。 

富集与目标蛋白质结合的 DNA 是 ChIP 的目标。在 ChIP 实验的特异性 DNA 产物可以量化之前，蛋白质和 DNA 之间的交联必须逆转。这通常通过大量热孵育和/或 蛋白酶 K对蛋白组分的消化来完成的。蛋白酶 K 可在脂肪族、芳香族或疏水残基的羧基位点切开。由于其广泛的特异性，

蛋白酶 K 通常用于去除 DNA 或 RNA 制剂中的蛋白。此外，蛋白酶 K 消化可以消除纯化 DNA 中的核酸酶，从而防止降解。 同样建议使用 RNase AIS 处理以获得更纯的 DNA 样品，并且如果您对酵母进行 ChIP ，则是必要的。应使用苯酚-氯仿提取或设计用于 DNA 纯化的离心柱对任何剩余蛋白中的 DNA 进行最终纯化。

ChIP 的特征之一是能够通过 qPCR 定量测定纯化的 DNA 产物；此举的理想产品是 Applied Biosystems PowerUp SYBR Green 预混液。qPCR 可在不同实验条件下分析靶蛋白-DNA 复合物水平。图 2 显示了通过芯片富集组蛋白 H2A-Ub 的富集，其中首先通过 qPCR 分析纯化的 DNA 以确定是否存在特定启动子区域，然后再对富集的蛋白进行 ChIP-Seq。免疫沉淀复合物与结合 DNA 之间数量上存在直接相关性。可以进一步处理纯化的 DNA ，为 ChIP-Seq 创建 NGS 库。

qPCR 提示：

• 设计引物，用于在 100 至 250 bp 之间扩增，T_M 介于 50°C 至 65°C 之间，而 Gs 或 Cs 非常适合位于引物末端。 
• 确认熔解曲线上的单峰。 
• 检查引物的效率 (如果这是首次使用此组引物)。理想情况下，您希望引物效率介于 90% 与 105% 之间。 
• 即使您的实验是 ChIP-Seq ，请通过 qPCR 检查几个目标区域以确认有效富集，然后发送 ChIP DNA 进行测序。 

• 首先需要计算百分比起始引物量。以下示例假定与 ChIP DNA 相比，在 qPCR 反应中使用 1% 的起始引物量。 对于稀释系数 (DF) ，您使用与实际稀释系数相对应的循环数；例如，对于 100 的稀释系数 (基于 1% 起始引物量) ，DF 为 6.64 个周期 (log₂ 100)。
• 接下来，您需要将 C_t 标准化为起始引物量：∆C_t = C_t [IP] – (C_t [起始引物量] – DF)
• 然后计算产量、或引物起始量百分比：产量 (%) = (引物效率)^–∆C_t x 100%
• 对于倍富集，将倍数变标准化为无抗体 (IgG) 对照品：∆∆C_t = ∆C_t [IP] – ∆C_t [IgG]
• 最后，计算倍数富集：倍数富集 = (引物效率)^–∆∆C_t

下表使用公式计算 H2A-Ub ChIP 实验中 SAT2 的产量和倍数富集 ，如 图 2所示。本例中的引物效率为 2，而 qPCR 反应的引物起始量为 1%。

1. Brind’Amour J 等著。(2015) 超低样本起始量的天然 ChIP-Seq 方案适用于对稀有细胞群进行全基因组分析。Nat Commun 6:6033.
2. Browne JA 等著。(2014) 分离 ChIP 原代上皮细胞染色质的优化方案。PLoS One 9(6):e100099.
3. Carey MF 等著。(2009) 染色质免疫沉淀 (ChIP)。Cold Spring Harb Protoc 4(9).
4. Flanagin S 等著。(2008) 基于微孔板的染色质免疫沉淀方法，矩阵 ChIP：研究复杂基因组事件信号传导的平台。Nucleic Acids Res 36(3):e17.
5. Sadeh S 等著。(2016) 以单核细胞分辨率阐明组合染色质状态。Mol Cell 63:1080–1088.
6. Tehranchi AK 等著。(2016) 转录因子与复杂疾病风险的合并 ChIP-Seq 链接变异。Cell 165(3):730–741.