Search Thermo Fisher Scientific
流式细胞术检测胞外囊泡
快速检测和量化单个粒子
正在积极研究包括胞外囊泡 (EV)，包括外泌体。EV 参与几个生物过程，包括 (1) 细胞间信号转导；(2) 转移蛋白质、脂质和核酸；(3) 疾病标志物。EV 的小尺寸、异质性和低折射率使它们难以鉴定。然而，流式细胞术可以用于分析单个粒子并且既提供细胞计数，又提供 EV 特性的表型分析。
使用流式细胞术的益处包括：
- 单个粒子分析-传统的 EV 分析方法在分析单个细胞的能力方面受限，并且往往耗时或昂贵。流式细胞术能够每秒分析数千个细胞，从而改善统计并允许量化独特和稀有的细胞类型。
- 粒子计数准确—Attune 流式细胞仪在绝对计数方法的速度和准确性方面均有显著优势。
- 能够配合试剂和抗体快速进行多重分析—通过用荧光标签（如表面蛋白、膜脂质、细胞酯酶及靶向细胞表面标志物和胞内标志物的抗体）同时分析，获得更多信息。
了解Attune 流式细胞仪以及哪些抗体和试剂鉴定和表征 EV。
Attune 流式细胞仪最大限度地减少巧合，以提供更准确的单个粒子分析
EV 往往需要明显稀释样品以确保检测单个粒子。样品中较高的粒子浓度导致更高重合，也称为群效应（图 1）。Attune 流式细胞仪配备声学辅助流体动力学聚焦，这允许快速分析高度稀释的样品，同时不增加重合次数（图 2）。我们建议您增添 488/10 侧向散射滤光片以及聚焦流体超滤，以降低背景噪声并实现辨别 100 nm 粒子。
点击放大图片
图 1.高度浓缩的样品产生多个囊泡作为单个事件检出的“群”信号。最大限度减少与样品系列稀释度高度重合。
点击图片放大
图 2. Attune 流式细胞仪使用声学辅助流体动力学聚焦运行非常稀薄的样品，同时重合事件较少。
表征 EV 的抗体和试剂
膜染料
荧光染料可用于统一标记来自细胞培养物的一群 EV。这些染料着染用于 EV 设门和检测的脂质和细胞膜。
- FM 亲脂性苯乙烯基染料: FM 1-43
- 长链亲脂性羰花青染料：DiI、CM-DiI（可固定）、DiO 和 DiD 或 Vybrant 多色细胞标记试剂盒
- Di-8-ANNEPS
胞内染料
胞内蛋白质和 DNA 可以用明亮的染料标记。RNA 染色更具挑战性。我们提供颜色种类繁多的几种染料，以帮助检测 EV 群体。
- CellTrace 染料和 CFSE 染料（囊泡内蛋白质）
- Hoechst 33342（DNA 染液）
用这些简单的小技巧从残片中检测您的 EV 群体
对照
为正确鉴定来自污染和残片的 EV 群体，对照至关重要。请记住包括以下对照：
- 仅缓冲液
- 缓冲液 + 所有试剂（无 EV）
- 仅缓冲液 + EV（无染液）
- 确保检测单个粒子的 EV 在缓冲液中样品稀释物
- 用于仪器表征的粒子
- 如果使用多重流式细胞术抗体，请设置 FMO 对照
- 配合 Triton™ X-100处理的阴性对照。用 Triton™ X-100 处理后，EV 膜应遭受扰动，并且任何推定性 EV 信号应当丧失。否则，观察到的信号可能归因于伪影。
防止污染
过滤所有液体并用经过滤的蒸馏水清洗移液器吸头，以尽量减少碎片和非样品 EV 的污染。我们建议您使用 0.1 μm 或更小的滤器。一个 500 毫升的瓶子将需要 12-24 小时真空来过滤所有液体。
样品制备
您也可以使用 Dynabeads 磁珠作为 EV 分离和流式细胞术检测的替代方法。
学习使用流式细胞仪分析外泌体工作流程的免费网络研讨会
标题：使用 Attune NxT 流式细胞仪分析外泌体上的表面抗原
主讲人：Steve McClellan, BS, MT, SCYM (ASCP)CM Manager, Basic & Translational Research Operations Chief, Flow Cytometry Core Laboratory, Mitchell Cancer Institute University of South Alabama
网络研讨会亮点：
- 外泌体分离方法
- 流式细胞术囊泡分析的最佳做法
- 外泌体的表面标志物分析
- 外泌体研究的重要性
参考文献
- Lötvall J, Hill AF, Hochberg F, et al.Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.J Extracell Vesicles.2014;3:26913.Published 2014 Dec 22.
- Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, et al.Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.J Extracell Vesicles.2013;2:10.3402/jev.v2i0.20360.Published 2013 May 27.