克隆分离和验证指南-赛默飞| Thermo Fisher Scientific - CN

在确定混合细胞群的切割效率后，分离单细胞克隆以便进一步验证和建库。您可以在 96 孔板中使用有限稀释克隆 (LDC) 或使用流式细胞仪进行单细胞分选，从而从选定池中分离单细胞克隆。

根据编辑效率和预估的细胞活力，您可以预估获得所需敲除 (KO) 克隆细胞系所需的单个克隆数量。

例如，如果您希望所获基因两个拷贝均有突变的纯合子 KO，而 GeneArt 切割检测效率为 50%，那么在任何细胞中两个等位基因敲除的概率为 25% (0.5 × 0.5 = 0.25)。

如果插入缺失导致移码的概率为 2/3，则存在纯合 KO 的可能性为每个细胞约为 11% [(0.5 × 0.5) × (0.66 × 0.66) = 0.11]。

建议通过每孔设置 0.8 个细胞进行有限稀释，此操作需要在转染后（完成细胞计数后），将细胞重新悬浮在完全生长培养基中，将密度调整至 8 细胞/mL，然后从悬浮液中取 100 μL 转移到 96 孔板的各个孔中。

如果您以这种方式至少设置 10 个 96 孔板，预期仅剩 20% 的细胞存活，那么在 192 个纯合子型 KO 克隆中存活的概率将为 19 – 21 个细胞 (192 × 11%)。

使用 500 μL PBS 清洗 24 孔板每个孔中的转染细胞。小心吸出 PBS 并丢弃。
向细胞中加入 500 μL TrypLE 细胞解离试剂，在 37°C 下孵育 2 – 5 分钟。
向细胞中加入 500 μL 完全生长培养基，以中和解离试剂。使用移液器将细胞上下移动多次，以分解细胞聚集体。确保细胞分离良好，不会聚集在一起。
以 300 × g 离心细胞 5 分钟，形成团块。
吸出上清液，将细胞重新悬浮于适量的预热 (37°C) 生长培养基中，然后进行细胞计数。
计数后，将细胞稀释至 8 个细胞/mL，达到生长培养基的密度。使用该细胞密度制备总计 50 mL 细胞悬液，然后转移至无菌储液槽中。
备注：您还可以进行连续稀释，以更精确得预估细胞密度。
使用多通道移液器，将 100 μL 的细胞悬液转移到 96 μL 孔组织培养板的每个孔中，直到满足所需接种数量的培养板。确保在接种平板之间混合细胞，以避免形成细胞聚集体。
备注：通常，我们接种十块 96 孔板以获得大量克隆。要接种的孔板数量取决于单细胞分离后混合细胞群的编辑效率和细胞活力。
将反应板在 37°C、5% CO₂ 培养箱内孵育。
在 4 倍显微镜下（根据细胞系的生长率，通常为第一周后）可见细胞的小聚集体后，立即扫描单个细胞集落平板。
继续孵育平板 2 – 3 周，扩大克隆群，以便进一步分析和表征。

您可以使用具有单细胞分选功能的流式细胞仪，将每个孔中的单个细胞分选到 96 孔板中。在分选和扩增单细胞克隆后，使用合适的分析方法分析和表征克隆群体。以下是 293FT 细胞的单细胞分选程序的示例。

使用 500 μL PBS 清洗 24 孔板每个孔中的转染 293FT 细胞。小心吸出 PBS 并丢弃。
向细胞中加入 500 μL TrypLE 细胞解离试剂，在 37°C 下孵育 2 – 5 分钟。
向细胞中加入 500 μL 完全生长培养基，以中和解离试剂。使用移液器将细胞上下移动多次，以分解细胞聚集体。确保细胞分离良好，不会聚集在一起。
以 300 × g 离心细胞 5 分钟，形成团块。
吸出上清液，然后使用 500 μL PBS 洗涤细胞团块。
在 1 mL FACS 缓冲液重新悬浮 1 × 106 个细胞，然后向细胞中添加碘化丙啶 (PI)，最终浓度为 1 μg/mL。将重新悬浮的细胞置于冰上。
先对细胞使用合适的滤光片进行过滤，然后在具有单细胞分选功能的流式细胞仪上对细胞进行分析。
将 PI 阴性细胞分选到含有 100 μL 完全生长培养基的 96 孔板中。如果需要，您可以将 1X 抗生素与完全生长培养基一起使用。
将反应板在 37°C、5% CO₂ 培养箱内孵育。
在 4 倍显微镜下可以看到细胞的小聚集体时，立即扫描单个细胞集落平板。集落应足够大，可在 7 至 14 天内观察到（根据细胞系的生长率，通常为第一周后）。您可以进行图像分析，以确保集落来源于单个细胞。
图像分析后，继续培养板 2 – 3 周，扩大克隆群，以便进一步分析和表征。

您可以通过各种分子生物系方法（例如基因分型 PCR、qPCR、下一代测序或蛋白质印迹）分析单细胞克隆的纯度和所需基因型（纯合子型或杂合等位基因）。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。