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全基因组扩增 (WGA) 是一种分子生物学技术，即使是极少量 DNA 甚至单个细胞，也可以扩增整个基因组，从而获得大量产物。此方法基于多重置换扩增。当起始材料为环形 DNA 时，采用滚环扩增 (RCA)。MDA-WGA 和 RCA 反应均在等温条件下使用链置换聚合酶（如 phi29 DNA 聚合酶）进行。
滚环扩增 (RCA)
RCA 过程涉及使用环形 DNA 模板，通常为质粒形式或环形寡核苷酸的形式。此模板通过 DNA 聚合酶进行扩增，如 phi29 DNA 聚合酶，此聚合酶与模板结合以合成新的 DNA 链。随着 DNA 聚合酶围绕环形模板移动，它持续合成新的 DNA 拷贝，从而实现指数扩增。此过程可重复多次，从少量起始样品中生成大量 DNA。
图1.滚环扩增 (RCA) 是一种利用链置换 DNA 聚合酶（如 phi29 DNA 聚合酶）从环形 DNA 模板生成长单链 DNA 的等温扩增技术。RCA 生成一个串联体，包含与环形模板互补的多个串联重复序列。
多重置换扩增-全基因组扩增 (MDA–WGA)
MDA-WGA 使用高持续合成能力的 DNA 聚合酶，如 phi29 DNA 聚合酶，在恒定温度下扩增 DNA。该过程从向 DNA 样品中添加随机六聚体引物开始，该引物与模板 DNA 杂交并启动 DNA 合成。
图2：多重置换扩增-全基因组扩增 (MDA–WGA)。基于多重置换扩增的全基因组扩增示意图。图中显示了 DNA 聚合酶（如 phi29 聚合酶）的链置换活性。
用于 MDA-WGA 和 RCA 的酶
phi29 DNA 聚合酶和 EquiPhi29 DNA 聚合酶是 MDA-WGA 和 RCA 的首选酶。Thermo Scientific EquiPhi29 DNA 聚合酶是一种通过体外 蛋白进化开发的专有 phi29 DNA 聚合酶突变体 [1]。此酶在蛋白热稳定性、反应速度、产物产率和扩增偏倚方面优于野生型 phi29 DNA 聚合酶。此外，它保留了野生型酶的所有优点，包括高持续合成能力（扩增长达 70 kb）、强劲的链置换活性和 3′→5′ 核酸外切酶（校正）活性。
表 1.EquiPhi29 和 phi29 DNA 聚合酶对比
| EquiPhi29 DNA 聚合酶 | phi29 DNA 聚合酶 | |
|---|---|---|
持续合成能力 / 链置换活性 | 高 | 高 |
最佳扩增温度 | 42°C | 30°C |
反应时间 | 2 小时 | 4—16 小时 |
校正活性 | 3‘→5‘ | 3'→5‘ |
保真度 | 高 | 高 |
| 灵敏度 | 1 fg—1 ng | 1 pg—1 ng |
| 产量 | 非常高 | 高 |
GC 序列偏好性 | 非常低 | 低 |
| 产品形式 | 单酶 |
EquiPhi29 DNA 聚合酶
Thermo Scientific EquiPhi29™ DNA 聚合酶是一种专有的 phi29 DNA 聚合酶突变体，具有强大的链置换活性，可实现快速、灵敏和高效的等温扩增，如滚环扩增 (RCA) 和多重置换扩增-全基因组扩增 (MDA-WGA)。与野生型 phi29 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶具有更高的热稳定性、反应速度、产物产量和更低的扩增偏倚。EquiPhi29 DNA 聚合酶可以独立和试剂盒形式提供。
特点：
- 快速—在 2 小时内扩增标靶
- 灵敏—实现 1 fg DNA 的灵敏度
- 高产量—产量高达 17 μg 扩增 DNA
- 多种样品—不同类型的样品起始材料（例如纯化的 DNA、液体培养基培养物、琼脂平板菌落）
- 各种应用—扩增产物可用于各种下游应用（DNA 测序 [例如 Sanger 测序、下一代测序 ]、使用限制性内切酶酶切、无细胞 DNA 富集和无细胞蛋白表达）
使用 EquiPhi29 DNA 聚合酶获得的 RCA 数据
与野生型 phi29 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶有助于确保更高的热稳定性、反应速度和产物产量（图 3 和 4）。
图3.与野生型 phi29 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶在更高工作温度下提供更高的产物产量。使用 EquiPhi29 DNA 扩增试剂盒和 Thermo Scientific phi29 DNA 聚合酶在不同温度 (25–45°C) 下，根据产品实验方法使用 0.1 ng pUC19 质粒进行 DNA 扩增 2 小时。使用 Invitrogen Quant-iT PicoGreen dsDNA 测定试剂盒对扩增 DNA 进行定量。在所有情况下，数据均以来自 n=3 份重复样品的 RCA 产量的平均值和标准差表示。
图4.与其他市售 phi29 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶可在更短的反应时间内提供较高质粒 DNA 产量。使用 EquiPhi29 DNA 扩增试剂盒在不同温度（30、42 和 45°C）下，使用 Thermo Scientific phi29 DNA 聚合酶在 30°C 下以及使用其他供应商试剂盒在推荐条件下对 0.1 ng pUC19 质粒 DNA 扩增 1-4 小时。 使用 Invitrogen Quant-iT PicoGreen dsDNA 测定试剂盒对扩增 DNA 进行定量。在所有情况下，数据均以来自 n=3 份重复样品的 RCA 产量的平均值和标准差表示。
EquiPhi29 DNA 聚合酶具有高灵敏度，可以使用有限量的靶标 DNA 起始材料进行扩增。与其他市售试剂盒相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶显示出更高或相似的灵敏度和产物产量。EquiPhi29 DNA 聚合酶可以达到 1 fg 质粒 DNA 的灵敏度（图 5）。
图5.少量 DNA 即可获得高灵敏度和高产物产量。使用 1 fg、1 pg 和 1 ng 的 pUC19 质粒 DNA 作为 RCA 反应起始物料，根据产品实验方法，使用 EquiPhi29 DNA 扩增试剂盒进行扩增。来自其他供应商的 RCA 试剂盒则根据各生产商推荐的实验方法予以使用。使用 Invitrogen Quant-iT PicoGreen dsDNA 测定试剂盒对 RCA 产物进行定量。在所有情况下，数据均以来自 n=3 份重复样品的 RCA 产量的平均值和标准差表示。
使用 EquiPhi29 DNA 扩增试剂盒进行 RCA 结合 Gibson 组装或基因自我环化，可以在 1 天内实现 DNA 构建和无细胞蛋白表达（图 6）。
图 6.传统质粒制备技术与使用 EquiPhi29 DNA 扩增试剂盒进行 Sanger 测序和无细胞蛋白表达的质粒制备技术比较。
EquiPhi29 DNA 聚合酶可在支持 RCA 的无细胞蛋白表达应用中确保快速高效地进行环形 DNA 扩增（图 7）。
图7.从单个菌落、Gibson 组装或自行环化反应产物进行直接 RCA 的产物以及高效无细胞蛋白合成和非扩增质粒产物。使用 1 µL RCA 反应物或 500 ng 纯化质粒作为起始物料，按照生产商建议，使用 RTS 100 大肠杆菌 HY 试剂盒 (Biotech Rabbit) 进行蛋白合成。每 5 分钟通过测量 GFP 荧光检测蛋白表达。所有 RCA 产物的表达水平均与非扩增纯化质粒相同。
图8.与其他 Bst DNA 聚合酶相比，可冻干 Bst DNA 聚合酶生成更多扩增产物。利用 1 ng、5 ng 和 10 ng 环形 ssDNA 模板起始物料、1:1 的引物和 ssDNA 比率在 RCA 反应中测定荧光信号强度。在 65°C 下进行 1 小时 RCA。使用 Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex 实时荧光定量 PCR 系统测定杂交 beacon 的荧光，根据无模板对照将其标准化。标准化荧光与 RCA 产物的量呈正相关。在所有情况下，数据均以来自 n=4 份重复样品的 RCA 产量的平均值和标准差表示。
使用 EquiPhi29 DNA 聚合酶获得的 MDA-WGA 数据
当扩增富含 GC 的靶标时，Thermo Scientific EquiPhi29 DNA 聚合酶的偏好性很低（图 9）。
图9.EquiPhi29 DNA 聚合酶在扩增细菌基因组时显示出较低的 GC 偏好性。 使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及来自另一家供应商的同类 DNA 聚合酶分别对含低 GC 含量（金黄色葡萄球菌，33% GC）、中等 GC 含量（大肠杆菌，51% Gc）和高 GC 含量（铜绿假单胞菌，68% GC）的细菌基因组混合物进行扩增。对于每个基因组，参考基因组的 GC 含量（以 100 bp windows 表示，灰色）被转换成未扩增基因组混合物的归一化的覆盖率（绿色）。在没有序列偏好性的情况下，所有 windows 应均匀分布且归一化覆盖度接近 1，以浅蓝色表示。使用不同聚合酶扩增后得到的归一化覆盖率。与其它 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶在所有 GC 含量范围内均可以最低的 GC 偏好性扩增 DNA 聚合酶。
EquiPhi29 DNA 聚合酶可以在 2 小时内从人类基因组 DNA 中获得高产量的靶序列（图 10）。
图10.与野生型 phi29 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶可在更短的反应时间内提供较高基因组 DNA 产量。根据产品实验方法，使用 EquiPhi29 DNA 扩增试剂盒在不同温度（30、42 和 45°C）下，使用 Thermo Scientific phi29 DNA 聚合酶在 30°C 下，对 0.1 ng 的人类基因组 DNA 进行 DNA 扩增 1–4 小时。使用 Invitrogen Quant-iT PicoGreen dsDNA 测定试剂盒对扩增 DNA 进行定量。在所有情况下，数据均以来自 n=3 份重复样品的 MDA-WGA 产量的平均值和标准差表示。
phi29 DNA 聚合酶
Thermo Scientific phi29 DNA 聚合酶是一种具有高持续合成能力的聚合酶，具有强大的链置换活性，可实现高效等温 DNA 扩增，如 RCA 和 MDA-WGA。
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EquiPhi29 DNA 聚合酶
参考文献：
[1] Povilaitis, T., Alzbutas, G., Sukackaite, R., Siurkus, J., & Skirgaila, R. (2016).In vitro evolution of phi29 DNA polymerase using isothermal compartmentalized self replication technique.Protein Engineering Design & Selection, 29(12), 617–628.
[1] Povilaitis, T., Alzbutas, G., Sukackaite, R., Siurkus, J., & Skirgaila, R. (2016).In vitro evolution of phi29 DNA polymerase using isothermal compartmentalized self replication technique.Protein Engineering Design & Selection, 29(12), 617–628.
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