活性 GTP 酶的沉降检测

Thermo Scientific 活性 GTPase 沉降检测试剂盒通过分离小 GTP 酶的特定下游效应物来分析其激活情况。

活性（GTP结合）小 GTP 酶很难被直接检测，因为没有一抗能够特异性识别活性形式。为了规避该问题， Pierce 试剂盒在检测前先进行沉降纯化，根据下游效应蛋白的亲和力区分活性GTP酶与非活性 GDP 结合构象。

这种亲和力为区分 GTP 酶活性种群的瞬时上调或下调与GTP酶表达的整体变化提供了一种方法。这些激活的瞬时变化可能是将细胞暴露于生长因子或其他小分子刺激物或抑制剂后的实验结果，也可能是细胞生长、分化、肿瘤形成和转移过程中发生的变化。

活性GTP 酶沉降检测试剂盒

活性GTP 酶与特定的下游效应蛋白相互作用。这些特定的蛋白质-蛋白质相互作用可用于在沉降检测中以效应蛋白为诱饵捕获活性GTP 酶。这些效应蛋白的GTP 酶蛋白结合域（PBD）以功能性 GST 融合蛋白的形式表达，可以固定到谷胱甘肽琼脂糖上，从而促进捕获和富集其同源 GTP 酶的活性形式。尽管效应蛋白通常与一种或多种活性 GTPase 相互作用，但可单独确定每种 GTPase 在沉降试验后通过 Western 印迹分析确定的相对数量。

Thermo Scientific Pierce 活性GTP 酶沉降检测试剂盒简化了 GTP 酶沉降检测程序，可用于 Arf1、Cdc42、Rac1、Rap1、Ras 和 Rho 小 GTP 酶。沉降亲和纯化步骤可在方便的离心柱中轻松完成。洗涤后，通过从谷胱甘肽树脂中洗脱 GST 融合蛋白来回收结合的 GTP 酶。使用每个试剂盒中提供的特异性抗体，通过蛋白印迹法检测纯化的 GTP 酶。活性 GTP 酶信号的相对差异可通过密度测定法或 CCD 相机进行量化。GTP 酶沉降程序已经过优化，可用于使用 Thermo Scientific SuperSignal West Pico 化学发光底物和 HRP 结合二抗（单独提供）的蛋白印迹分析。

试剂盒特点

  • 高度灵敏、准确—试剂、抗体和蛋白印迹法确保精确的控制和半定量结果
  • 方便—无需表达和纯化自己的 GST-PBD 融合蛋白或使用昂贵的抗体亲和树脂
  • 易于使用—2 小时即可获得成功
  • 高效—离心柱可将液体与树脂分离，防止样品损失和交叉污染
  • 完整—试剂盒包括亲和纯化试剂、对照、细胞裂解缓冲液和蛋白印迹法检测抗体
  • 经过验证—试剂盒经过功能测试，确保质量和性能
  • 兼容—试剂盒适用于多种细胞类型（如小鼠、大鼠和人类细胞）

应用

  • 跟踪细胞分化过程中特定 GTP 酶的激活
  • 确定小分子药物对激活小 GTP 酶通路的影响
  • 研究小分子抑制剂对 GTP 酶激活的影响

检测方法概述

使用活性 GTP 酶沉降和检测试剂盒进行沉降检测非常简单。首先，使用试剂盒中提供的裂解液从培养的细胞中制备全细胞裂解液。裂解液（含有活性和非活性 GTP 酶）与来自下游效应蛋白的 GST 蛋白结合域（PBD）融合蛋白和谷胱甘肽树脂一起孵育。这种特定的相互作用能够分离出目标活性（GTP 结合）GTP 酶。使用离心柱去除未结合的裂解蛋白，包括非活性或 GDP 结合的 GTP 酶。采用 SDS-PAGE 上样缓冲液回收谷胱甘肽树脂中的活性 GTP 酶群，并通过免疫印迹进行分析。

Active-GTPase-Pull-Down-278pxThermo Scientific 活性 GTP 酶沉降和检测试剂盒检测摘要。

试剂盒详细信息

目录 号GTP 酶下游效应物结合结构域-GST 融合关键细胞功能
16121Arf1GST-GGA3-PBD将包被蛋白组装到跨高尔基体网络和内体上的囊泡上
16119Cdc42GST-Pak1-PBD丝状伪足、片状伪足形成和应力纤维
16118Rac1GST-Pak1-PBD丝状伪足、片状伪足形成和应力纤维
16120Rap1GST-RalGDS-RBD细胞增殖/分化
16117RasGST-Raf1-RBD细胞增殖/分化；运动力
16116RhoGST-Rhotekin-RBD丝状伪足、片状伪足形成和应力纤维；运动性
每个活性 GTP 酶沉降检测试剂盒都含有足够多的材料，可用于对 0.5 至 1 mg 的细胞裂解液样品进行 30 次沉降检测，试剂盒中包含以下成分：GST 融合蛋白（含 GTP 酶特异性结合结构域）、谷胱甘肽琼脂糖树脂、GTPγS（阳性对照）、GDP（阴性对照）、裂解/结合/洗涤缓冲液、GTP 酶特异性一抗、SDS-PAGE 样品上样缓冲液、离心柱和收集管。

精選产品数据

活性 GTP 酶沉降检测试剂盒的有效性来自于 GST 效应物结合域的完整性和试剂盒中一抗的质量。在检测活性 Ras 的现有商业检测方法中，每种产品都能检测到相似的激活模式，但活性 GTP 酶沉降检测试剂盒比其他供应商的沉降和酶联免疫吸附试验试剂盒更灵敏。

16117-004-Ras-Pull-Down-349px-1Thermo Scientific 活性 Ras 沉降检测试剂盒比其他市售试剂盒更灵敏。NIH3T3 细胞在血清饥饿状态下，用血小板衍生生长因子（PDGF）刺激指定时间。制备裂解液，通过沉降、蛋白印迹法和密度测定法（A、B 组）或直接通过酶联免疫吸附试验（C 组）确定内源性活性Ras的量。虽然活性 Ras 水平呈现相似趋势，但皮尔斯活性Ras沉降检测试剂盒（图 A）在蛋白印迹法中的背景更低（数据未显示），且灵敏度更高。所有检测均按照制造商的说明进行。

其他产品数据和信息

参考文献

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仅供科研使用，不可用于诊断目的。