脱盐和缓冲液置换均采用凝胶过滤色谱（或分子排阻色谱）从较小分子中分离可溶性大分子。采用水溶液经色谱柱运输样品的技术称为凝胶过滤色谱。脱盐和缓冲液置换是两种使用最广泛的凝胶过滤色谱应用，两者均可使用相同的材料进行。

介绍

在脱盐和缓冲液置换中，样品中的大分子组分在缓冲液中进行回收，该缓冲液用于预平衡处理样品的凝胶过滤基质。当目标为用水交换样品中的缓冲盐（使用水预平衡凝胶过滤树脂）时，该方法通常称为脱盐。缓冲液置换是样品中的一组缓冲盐置换为另一组时所用的术语。

脱盐的应用包括：

  • 从蛋白质溶液中去除盐
  • 从核酸制剂中去除苯酚或未结合的核苷酸
  • 从偶联蛋白中分离过量交联、标记或衍生化试剂

缓冲液置换用于在进行后续应用之前将蛋白溶液置于更合适的缓冲液中，例如：

  • 电泳
  • 离子交换（IEX）
  • 亲和色谱（AC）
将蛋白质样品通过多孔树脂色谱柱，有助于缓冲液置换和脱盐。 原始样品中的小分子（红色）会进入微珠孔，因此比蛋白质（黄色）在色谱柱中的路径更长且速度更慢。因此，蛋白质从原始缓冲盐中分离并交换至色谱柱缓冲液中。

由于两种方法均基于类似的截留分子量（MWCO）限度范围，可以根据尺寸排除分子，因此凝胶过滤色谱可用于多种与透析相同的用途。与透析相比，凝胶过滤具有速度优势（几分钟，而透析用时几小时），这在某些实验情况下是必要的。例如，还原肽必须快速脱盐，以在还原剂氧化回二硫化物之前去除还原剂并启动后续的巯基反应步骤。此外，凝胶过滤与溶解或以其他方式损害透析膜完整性的有机溶剂和其他溶剂兼容。最后，与透析相比，凝胶过滤色谱允许在相对较小的体积中去除污染物（并且留在色谱柱上），这是处理有毒或放射性物质时的重要特征。

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凝胶过滤色谱工作原理

凝胶过滤基于不同尺寸分子渗透至合适的固定相或色谱树脂中的相对能力来分离这些分子。树脂具有尺寸排阻性能且由层析介质（通常为尺寸较小、不带电荷的多孔颗粒的水溶液）填充，用于样品的分离。树脂颗粒具有一系列孔径，用于确定可分离分子的大小。平均或最大有效孔径定义了所谓的分离范围或树脂排阻限度。小于分离范围的分子可以进入树脂孔，而大于分离范围的分子则被阻止进入孔中。

当样品溶液通过填充凝胶过滤树脂色谱柱时，样品中的小分子（缓冲盐、小分子等）进入其遇到的树脂微珠孔中，并被迫按照迂回路径前进随后离开微珠。相比之下，大分子则围绕树脂微珠周围流动，经相对直接的路径通过色谱柱。实际上，小分子经历的色谱柱体积比大分子大得多。（请记住，树脂微珠含极多孔；总体积中的大多数为水）。因此，当样品通过色谱柱中填充树脂床的距离时，小分子和被排斥分子的流速差异可使较快的大分子与较慢的小分子分离。

观看关于使用凝胶过滤色谱进行样品脱盐的视频

使用适当的凝胶过滤树脂可将多种不同类别的大分子与缓冲盐、未偶联的标记试剂和其他分子分离，以在下游应用前实现快速纯化。将样品通过色谱柱可实现以上目的，该色谱柱的树脂床足够高、体积足够大，与小分子相比，可完全分离从色谱柱末端洗脱的大分子。通过收集小份组分，易于将大分子与后续组分中洗脱的小分子分离。

如上所述，凝胶过滤可有效用于蛋白质脱盐，通过首先将凝胶过滤色谱柱与水平衡来实现。而缓冲液置换是通过首先用目标缓冲液对色谱柱树脂进行平衡来实现。在凝胶过滤的脱盐和缓冲液置换模式下，将样品载入色谱柱的缓冲液成分均将被树脂床中最初饱和（即预平衡）的溶液所取代。当加载的样品进入树脂床时，它将取代已存在于色谱柱中的等体积水或缓冲液。随着样品被推动通过色谱柱（通常通过在色谱柱顶部添加更多的缓冲液），平衡溶液会被推出色谱柱末端。由于大分子是在最初将其载入的缓冲液前从色谱柱中洗脱出来，因此最终在平衡溶液中洗脱出色谱柱。如下详细所述，有三种方法可用于进行凝胶过滤，即采用重力流色谱柱（滴落色谱柱）、离心色谱柱或纯化色谱柱。

赛默飞世尔科技开发了多种蛋白质样品脱盐策略。例如，Thermo Scientific Zeba 脱盐离心板、离心柱和含独特凝胶过滤树脂的纯化柱，专门设计用于在各种蛋白质浓度和样品量范围内提供一致的性能。即使稀释的蛋白质样品也可实现高蛋白质回收率。

脱盐离心色谱柱的比较。使用 Zeba 脱盐离心色谱柱（7K MWCO，10 mL）和一次性 PD-10 脱盐色谱柱（GE Healthcare）对 0.04、0.2 和 1 mg/mL 浓度的 1.5、2.5 和 3.5 mL 牛血清白蛋白（BSA）样品进行脱盐。按照每家生产商针对离心或滴落（重力）程序的推荐方案进行脱盐。将三组色谱柱在最终缓冲液中进行平衡，然后加入 1.5、2.5 和 3.5 mL 样品。对于各电泳凝胶，在泳道 1 中加入等于 1 μg BSA 的起始样本的等份试液作为上样对照品；在凝胶中加入体积相同的其他所有脱盐样本作为上样对照品。不同泳道之间的强度差异是脱盐引起的蛋白回收率和样本稀释度组合。本实验结果表明，与 PD-10 色谱柱相比， Thermo Scientific Zeba 色谱柱 在更广泛的样品浓度和体积范围内实现更高的蛋白回收率和更少的样品稀释。

 

凝胶过滤色谱法

凝胶过滤的三种常用形式包括重力流色谱柱、离心色谱柱或色谱纯化柱。重力流或滴落色谱柱和色谱纯化柱使用缓冲液追踪中的柱头压来推动样品通过凝胶过滤基质。离心色谱柱使用离心力使样品移动通过基质。

重力流色谱柱通过直立色谱柱的顶部上样，然后沉入树脂床。然后在色谱柱顶部加入额外的缓冲液或水，将样品从色谱柱中洗脱出。在这一过程中，收集小份组分并对各目标蛋白或其他大分子进行检测。在某些情况下，几份组分可能均含有蛋白，可能需要进行合并以提高产量。

色谱纯化柱的工作方式与重力流色谱柱大致相同，不同之处是系统为封闭状态，液体在注射器柱塞、泵或其他设备产生的液体压力下被压入设备中。

Thermo Scientific 提供各种脱盐色谱柱以及色谱纯化柱，用于高效去除盐和回收蛋白。Thermo Scientific Pierce Zeba 脱盐色谱柱（7K MWCO，5 mL）含有脱盐或缓冲液置换所用的高性能 Zeba 树脂。Zeba 树脂是去除低分子量化合物（包括盐类、荧光染料、生物素以及其他小分子标记试剂）的理想选择。可以处理蛋白质样品，具有出色的蛋白质回收性能，能去除 ≥95% 的盐类及其他小分子污染物（< 1000 Da）。

使用脱盐色谱纯化柱高效去除盐并回收蛋白。在 5 mL Thermo Scientific Pierce Zeba 纯化色谱柱（7K MWCO）中加入含牛血清白蛋白（1 mg）的 1 M NaCl ，流速为 5 mL/分钟。纯化色谱柱曲线显示了通过传导率（棕色）检测到的 BSA（蓝色）和 NaCl 的等度洗脱。超过 95% 的 BSA 已回收， 95% 以上的盐已去除。

离心或离心色谱柱的独特之处在于离心机产生的力足以使样品通过树脂床而无需任何缓冲液追踪。离心力会导致凝胶基质出现一定程度塌陷，这有助于挤压样品通过和离开色谱柱底部，并捕获进入树脂微珠孔的小分子。离心脱盐不仅比重力流和纯化色谱柱形式更快，还减少了样品稀释量。

凝胶过滤色谱参数

选择适合待脱盐样品体积的色谱柱尺寸很重要。色谱柱过大会导致蛋白样品被稀释。如果色谱柱过小，低分子量污染物将无法与目标大分子充分分离。选择适合样品体积的色谱柱尺寸将尽可能减少稀释，实现完全高效的分离。通常，树脂床体积为 4 至 20 倍样品体积的色谱柱便足够。通常被排阻体积（即大分子可用的色谱柱体积）约为树脂体积的 35% ，而小分子可用的总体积几乎等同于树脂床体积。

凝胶过滤树脂床的分子排阻限度也很重要。针对典型脱盐和缓冲液交换应用（相对于分子排阻色谱的其他类型应用），选择分子排阻限度（MWCO）在 2000 至 7000 之间的树脂通常较佳。实际上，想要去除的小分子必须比 MWCO 小数倍；想要分离的大分子（如蛋白）必须至少与 MWCO 一样大。针对其他应用，例如从正常尺寸蛋白中分离肽类，可能需要具有较大排阻限度 （例如 40K）的树脂。请注意，由于小分子几乎可以自由（即没有迂回路径）通过基质孔，因此具有较大排阻限度的树脂并非总适用于缓冲液置换和脱盐。

市售凝胶过滤树脂通常持久耐用，耐化学腐蚀且具有惰性，并且具有极小非特异性结合特性。因此，几乎所有的缓冲液系统均可有效用于脱盐和缓冲液置换。将蛋白脱盐至水平衡的色谱柱时，峰展宽可能导致样品稀释度更高，分离效果比使用缓冲溶液时更差。通常，使用具有某些离子特性的缓冲溶液可获得更好的结果。作为替代方案，可在脱盐缓冲液中加入挥发性电解质（如醋酸盐吡啶，碳酸氢铵和乙二胺醋酸酯），以提高离子强度，并在分离精密度对于实验成功至关重要时降低拖尾效应。之后可通过冻干轻松去除这些添加剂。

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推荐阅读
  • Porath, J. and Flodin, P. (1959(Gel filtration: a method for desalting and group separation.Nature 183: 1657-1659.
  • Walker JM.2009.The Protein Protocols Handbook.Third Edition.Springer-Verlag New York, LLC.

仅供科研使用，不可用于诊断目的。