亲和纯化概述

目标蛋白质和其他大分子可以通过多种方法从粗提取液或其他复杂混合物中进行纯化。选择性沉淀可能是从其他大分子中分离一种大分子的最简单方法。 

 但是，大多数纯化方法都涉及某些形式的色谱法。在这些方法中，溶液中的分子(流动相)基于与固定材料(固定相)间的化学或物理相互作用的差异进行分离。凝胶过滤(又称为尺寸排阻色谱或 SEC)使用多孔树脂材料基于尺寸分离分子(即物理排阻)。在离子交换色谱法中，分子按照其与固相材料总体离子相互作用的强度进行分离(即非特异性交互)。

相比之下， 亲和色谱法（又称为亲和纯化）利用分子间的特异性结合相互作用。特定配体通过化学方法固定化到或“偶联”至固相载体，以便复杂混合物通过色谱柱时，这些与配体具有特异性亲和力的分子就会结合在一起。洗掉其他样品组分之后，结合的分子从载体剥离，实现从原始样品纯化。

每个特异性亲和系统都需要自己的一组条件，对指定的研究用途都有自己独特的挑战。其他蛋白质方法文章介绍了与特定纯化系统有关的因素和条件（参见本页结束时侧栏中的链接）。然而，所有配体-靶标结合系统所涉及的基本原理相同，并且这些概念是本概述的重点。

亲和纯化一般包含以下步骤：

1. 使用亲和载体培养原始样品（例如细胞裂解液、细胞培养上清、或血清），允许样品中的靶分子与固定化配体相结合。
2. 使用可保持靶标和配体之间结合作用的适当缓冲液，冲走载体中未结合的样品组分。
3. 通过改变缓冲液条件，使结合作用不再存在，从固定化配体中洗脱（分离并回收）靶标分子。

使用固定到固相载体上的抗体的小规模亲和纯化。 色谱法有三个主要的组成部分：包含蛋白质的流动相或溶剂、固定相或固相（又称为培养基或树脂，可能是琼脂糖或 其他多孔树脂）以及色谱柱。亲和色谱法具有高度选择性，提供高分辨率以及中到高的载样量。在有利于特异性结合到配体的条件下，目标蛋白质紧密结合到树脂上，并且未结合的污染物被洗掉。然后，通过改变条件以有利于洗脱，以高度纯化的形式回收结合蛋白。洗脱条件可能具有特异性（比如竞争性配体）或者非特异性（比如更改 pH 值、离子强度或极性）。靶标蛋白以纯化和浓缩形式进行洗脱。

样品(细胞裂解液、细胞培养上清、或血清)单次通过亲和柱就可以实现特定蛋白质1000倍以上的纯化，所以凝胶电泳（如 SDS-PAGE）分析后仅检测到一个条带。 

最常见的是，通过在配体官能团（例如伯胺、 巯基物质、羧酸、醛类）和载体反应基团之间形成共价化学键，配体固定化或直接“偶联”到固相载体材料上（参阅共价固定化的相关文章）。然而，间接偶联方法也是可行的。例如，谷胱甘肽 S-转移酶（GST）标记的融合蛋白通过谷胱甘肽-GST 亲和作用首先被捕获到谷胱甘肽载体上，然后通过二次化学 交联 将其固定化。然后可以使用固定化 GST 标记的融合蛋白亲和纯化融合蛋白的结合配偶体。 

与一般类蛋白质（例如抗体）结合的配体或者常用的融合蛋白标签（例如 组氨酸 标记或 His-标签）已经实现商用，采用预先固定化的形式，可随时用于亲和纯化。或者，更专用的配体，比如感兴趣的特异性抗体或抗原，可以使用其中一种商用活性亲和载体进行固定化；例如，肽抗原可以固定化到载体上，用于纯化可识别肽段的抗体。

涉及 蛋白质:配体 相互作用的大多数亲和纯化程序使用相应生理 pH 值和离子强度的结合缓冲液，比如磷酸盐缓冲液（PBS）。当 抗体:抗原 或天然 蛋白:蛋白质相 互作用是亲和纯化的基础时尤其如此。一旦发生结合作用，则使用额外的缓冲液冲洗载体，以清除样品中 未结合 的组分。通过添加低含量洗涤剂，或者通过适当调节结合和/或洗涤缓冲液中的盐浓度，可以将非特异性（例如简单离子）结合作用降至最低。最后，添加洗脱缓冲液，以破坏结合作用并释放靶标分子，然后以纯化形式进行收集。

通过极端 pH 值（低或高）、高盐（离子强度）、使用可以使一种或两种分子变性的洗涤剂或 离液 剂，清除结合因子或者与反配体竞争，洗脱缓冲液可解离结合配偶体。在大多数情况下，需要随后进行透析或脱盐将纯化蛋白从洗脱缓冲液交换到更合适的缓冲液中，进行储存或下游分析。

在基于蛋白相互作用的亲和纯化中，最广泛使用的洗脱缓冲液是 0.1 M 甘氨酸•HCl（pH 值 2.5-3.0）。此缓冲液可以有效解离 大多数蛋白质:蛋白质 和 抗体:抗原 结合作用，而不会对蛋白质结构造成永久性影响。但是，低 pH 值会损害一些抗体和蛋白质，因此洗脱的蛋白分段最好通过立即添加 1/10 容量的碱性缓冲液（比如 1 M Tris•HCl，pH 值 8.5）进行中和。下表列出了用于蛋白质亲和纯化的其他洗脱缓冲液。   

这些条件主要适用于蛋白质-蛋白质结合作用，比如抗体及其肽抗原间结合作用。用于其他分子类型间结合作用的洗脱缓冲液可能大不相同。

亲和纯化涉及基于与固定化到固定材料（固相）的配体间的结合作用的差异来分离溶液（流动相）中的分子。亲和纯化中的载体或基质可以是生物特异性配体与之共价键合的任何材料。  通常，用作亲和基质的材料不溶于发现靶标分子所在的系统。不溶性基质通常为固体，但并不总是如此。数百种物质已经过描述并用作亲和基质，包括琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、聚丙烯酰胺、乳胶和可控孔度玻璃。有用的亲和载体应具有高表面积与体积比率、化学基团易修饰以与配体共价键合、最低限度的非特异性结合属性、良好的流动特性以及机械和化学稳定性。

多孔载体（又称为树脂或凝胶）一般提供对蛋白质亲和纯化最有用的属性。这些类型的载体通常为糖或丙烯酰胺基聚合树脂，在溶液中（即水合）生成直径 50-150 µm 的微珠。 微珠状形式允许以湿浆形式供应树脂，能够轻易分配以将任意大小的树脂床填充和“装入”色谱柱。"" 微珠非常多孔且足够大，生物分子（蛋白质等） 可以自由流入和穿过微珠，就像它们位于微珠表面之间和周围一样。配体通过各种方式与微珠聚合物共价键合（外表面和内表面）。结果造成基质松动，样品分子可以自由流过固定化配体的高比表面积。

到目前为止，蛋白亲和纯化技术最广泛使用的基质是交联微珠状琼脂糖，通常提供 4% 和 6% 密度。  （这意味着 1 mL 树脂床，90% 以上的体积是水。）微珠状琼脂糖适合常规应用，因其容易压碎，适合重力流动、低速离心和低压程序。对微珠状琼脂糖树脂额外进行交联和/或化学硬化，可增强其耐受更高压力的能力，但是也会导致结合力下降。  

基于聚丙烯酰胺的树脂还用作色谱柱亲和色谱法的载体。一个示例是 Thermo Scientific UltraLink Biosupport，它不像典型微珠状琼脂糖那样容易压缩。 UltraLink Biosupport 可用于配合蠕动泵或其他液相色谱系统进行的中等压力应用。琼脂糖和 UltraLink 载体均具有低非特异性结合特性；然而，它们在特定应用中的表现可能略有不同。

4% 的交联 微珠状琼脂糖和 6% 的交联 微珠状琼脂糖通常分别缩写为琼脂糖 CL-4B 和琼脂糖 CL-6B。还请参阅下表了解基于使用规模选择载体。 

磁性微粒是与微珠状琼脂糖和其他多孔树脂完全不同的亲和载体类型。它们要小得多（通常直径为 1-4 µm），且为固体（无孔）。其小尺寸为有效的配体固定化和亲和纯化提供了足够的表面积与体积比例。磁珠是共价包被硅烷衍生物的超顺磁氧化铁微粒而产生的。    包被使微珠产生惰性（最小化 非特异性结合）并提供与目标配体键合所需的特定化学基团。

使用磁性微粒进行亲和纯化并不在色谱柱内完成。相反，数微升磁珠与数百微升样品混合，成为松散的浆料。混合过程中，微珠保持悬浮在样品溶液中，允许与固定化配体发生亲和作用。提供充分的结合时间后，使用强大磁铁收集微珠并与样品分离。通常在 微量离心 管中完成简单的台面操作程序，通过移液或倾倒操作清除样品（或清洗液等），同时使用合适的磁铁将磁珠固定到离心管底部或侧面。

磁性微粒与多孔树脂相比的优势：

• 磁珠比多孔载体表现出更少的非特异性结合。
• 磁珠可用于细胞分离程序。
• 磁珠适合高通量自动化。

磁珠通常取代琼脂糖树脂作为 免疫沉淀 (IP) 下拉试验等检测规模纯化技术的首选载体。此外，还有日益成熟和强大的样品处理仪器使用磁性分离执行检测和纯化程序。

纯化和下游应用的预期规模可能是考虑使用哪种类型亲和载体的最重要考虑因素。压力极限（见上表）、最大流速及成本（例如大规模使用磁性微粒可能成本过高）等因素的差异决定了在指定色谱系统中适合使用哪种载体。

不同类的亲和靶标，以及不同的纯化目标，开发成功程序需要考虑不同的优先级（例如高纯度与高得率）、技术限制和缓冲液条件。以下章节介绍了一些最常见的亲和纯化系统。灰色框内提供了关于特定纯化方法的更详细文章的链接。

多种抗体纯化方法涉及亲和纯化技术。典型的实验室规模抗体生产涉及相对少量的血清、腹水或培养上清液。根据抗体用于各种测定和检测方法的方式，必须进行部分或完全纯化。三种水平的纯化特异性包括以下方法：

• 使用硫酸铵进行沉淀。这一简单技术为来自其他血清蛋白的总免疫球蛋白提供粗纯化。
• 使用固定化蛋白 A、G、A/G 或 L 进行亲和纯化。这些蛋白质可与大多数种类和子类的 IgG 相结合，这是哺乳动物响应 免疫原而生成的最丰富的免疫球蛋白类型。含有这些蛋白质的即用型树脂和纯化试剂盒提供多种包装尺寸和规格。
• 使用固定化抗原进行亲和纯化。共价固定纯化抗原（即用作免疫原的肽或半抗原，用于诱导宿主动物产生抗体）到亲和载体可实现从粗样品纯化特异性抗体。    提供通过各种化学方法制备固定化抗原的活性树脂和整套试剂盒。
   

在检测中，特异性抗体最常用于检测目标抗原，但是它们也可以用于纯化抗原。因为商业生产或获得特异性抗体成本高昂，此方法很少用于大规模抗原纯化。相反，其使用几乎完全局限 于 非常小的规模，最重要的就是用于 免疫沉淀 检测（见下一节）。

然而，当纯化抗体可用时，它可以通过任何一种高效结合化学方法共价固定到微珠状琼脂糖或其他亲和载体。通过伯胺实现共价固定化，与使用 Thermo Scientific AminoLink Plus 偶联试剂盒一样，是一种尤其简单且有效的抗体亲和柱制备方法。       

免疫沉淀 (IP) 指的是使用特异性抗体对抗原进行小规模亲和纯化。传统 免疫沉淀 涉及使用固定化蛋白 A 或 G 琼脂糖树脂（蛋白 A 或 G 与抗体结合，抗体与其抗原结合）捕获抗体-抗原络合物，然后回收上样缓冲液中的纯化抗原进行凝胶电泳。

免疫共沉淀 (Co-IP) 涉及尝试捕获并检测与抗原相互作用（即结合）的细胞裂解液中的直接抗原和任何蛋白质。  在使用蛋白 A 或蛋白 G 的传统形式中，此纯化方案涉及不少于三个水平的亲和作用。

通过调整并优化其他抗体固定化方法以满足 IP 和 Co-IP 所需的小规模需求，已开发出多项创新来克服与传统 IP 技术有关的很多限制和并发症。

类似于免疫共沉淀，下拉法检测也是经常用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的亲和方法。但是，与 IP 或 Co-IP 不同的是，下拉法不涉及使用对所研究靶蛋白具有特异性的抗体。下拉法检测的最低要求是用于“下拉”蛋白结合配偶体（猎物蛋白）的纯化和标记蛋白（诱饵蛋白）的可用性。通过融合蛋白的克隆和表达，或者作为共价修饰，比如加入生物素标记（参见接下来的两个主题），可创造诱饵蛋白。标记的（例如 生物素化的）诱饵蛋白可以固定化到标记特异性的亲和载体（例如链酶抗生物素蛋白）上。然后，固定化诱饵蛋白使用可与诱饵结合的蛋白质溶液表达蛋白（猎物蛋白）进行培养。然后就可以鉴定这些诱饵-猎物蛋白络合物。或者，活性载体可用于直接固定几乎任何诱饵分子。

当蛋白质以重组方式表达时 ，经常会附加其他氨基酸、功能域或整个蛋白质以辅助纯化和处理。重组蛋白的这些附加物被称为融合标签，且被添加至 DNA 对天然蛋白质序列进行编码。一种最常见的融合标签是由六到九个组氨酸残基（称为 6xHis 或 polyHis 标签）组成的一个短字符串，将与镍或钴等金属离子相结合。  另一种融合标记为谷胱甘肽 S-转移酶（GST），它与 还原型 谷胱甘肽紧密结合。

其他融合标签包括 HA、 Myc、FLAG（Sigma-Aldrich Co.）、MBP、SUMO 和蛋白 A。与 His 和 GST 标签不同，这些标签中大多数被称为抗原决定簇标签，因为它们需要特异性抗体（例如固定化抗-HA 抗体）进行纯化。抗原决定簇标签很少用于大规模纯化，因为基于抗体的亲和树脂比镍或谷胱甘肽琼脂糖等简单配体培养基的成本较高。相反，抗原决定簇标签更常用于小规模免疫沉淀 (IP) 或 Co-IP。    

融合标签的属性可实现在实验室内轻松处理标记蛋白。最重要的是，良好表征的标签-配体化学能够使用相应配体的固定化版本对标记分子进行单步亲和纯化。融合标签抗体同样广泛应用于下游检测和测定方法，无需为每个特异性重组蛋白取得或开发探针。

生物素又称为维生素 H，是所有活细胞中少量存在的小分子 (MW 244.3)。生物素分子的戊酸侧链可以通过衍生化加入各种反应基团，反应基团用于将生物素结合到其他分子。    一旦生物素与分子键合，使用基于 抗生物素蛋白 或链霉抗生物素蛋白的偶联物或载体与生物素基团进行强烈和特异性结合，就可以捕获分子进行检测、固定化或亲和纯化。

 抗生物素蛋白 和链霉抗生物素蛋白的天然和重组衍生物提供各种现成的修饰、标记和固定化形式。"抗生物素蛋白-生物素系统"（所有生物素亲和方法的通用标题）已适合在很多种研究应用中进行检测或纯化。

因为抗生物素蛋白-生物素亲和作用如此之强，对已经捕获到固定化抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白载体的生物素化靶标进行洗脱通常是不切实际的。   尽管如此，生物素标记试剂的改进版本已经开发出来，比如可分裂的生物素、亚氨基生物素和脱硫生物素；这些生物素与链霉抗生物素蛋白之间相互作用容易可逆，使其成为软释放应用的有用工具。   

除了可实现非常特异性靶标（例如特定抗原或工程标签）纯化的亲和载体和配体，特定种类的配体也能实现特定种类生物分子的一般富集或分离。蛋白 A 和蛋白 G，如上文所讨论，可视为这种类型亲和系统的示例，因其与一般种类的免疫球蛋白相结合。通常，如果能够确定合适的亲和配体，靶标分子组所有成员共享的任何独特的化学属性或官能团都能成为富集或分离方案的基础。

翻译后修饰 (PTM) 是可另外定义不相关分子组的此类官能团的一个很好的例子。根据大多数已知的化学配体，无论是磷酸化、糖基化还是 泛素化，PTM 的化学性质与其他化学基团都只有细微的区别。因此，任何亲和系统最多只能富集目标种类的化合物。

在一些情况下，亲和纯化的目标是清除样品中特定种类的不良组分，而不是纯化靶标分子。从这个意义上来说，污染物清除和传统亲和纯化的唯一差异在于一个希望保留样品流穿液并丢弃结合的分子。在这 种 情况下，重要的是结合缓冲液适合样品回收。

从蛋白质或其他大分子样品基本清除小分子量化合物通常通过凝胶过滤（见下一节）完成，而不是通过亲和色谱法完成。但是，在不需要的污染物无法通过尺寸进行区分、已知亲和配体可以与样品中的污染物特异性结合的情况下，亲和纯化才有用。

通常在净化程序结束时通过亲和力清除污染物。例如，细胞裂解和蛋白质增溶所必需的洗涤剂可能干扰下游应用和检测。    在这些情况下，提供数种洗涤剂结合树脂来处理样品。

希望清除特定组分的另一种情况是血清样品的蛋白质组学分析。通常该分析的焦点是这些蛋白质在血清或血浆样品中远没有白蛋白和 IgG 丰富。基于特异性抗白蛋白和抗 IgG 抗体或者基于其他配体（结合白蛋白的汽巴龙 染料以及结合 IgG 的蛋白 A/G）的亲和树脂在这些情况下特别有用。 

凝胶过滤（又称为尺寸排阻色谱或 SEC）使用多孔树脂基于尺寸分离分子。小分子进入树脂的微孔中，采取迂回路线穿过色谱柱；相比之下，大分子被微孔排除在外，绕过微珠的内部空间，比小分子更快速地通过色谱柱迁移。

离子交换色谱法（IEX 或 IEC）根据蛋白质与树脂上带负电荷或带正电荷的基团间总体离子相互作用的强度来分离这些蛋白质。通过操纵缓冲液条件(例如离子强度和 pH 值)，离子性更强或更弱的分子可以与固相材料结合或与之解离。  IEX 载体可能带正电荷（用于阴离子结合）或带负电荷（用于 阳离子 结合）。此外，阴离子和 阳离子 IEX 的载体可以表征为强或弱相互作用；这里描述的不是结合的强度，而是离子化随 pH 值的变化。与强交换剂结合时，结合力随 pH 值的变化极小；与弱交换剂结合时，结合力随 pH 值的变化很大。    

疏水作用色谱法 (HIC) 基于蛋白质的外部疏水氨基酸残基与树脂的疏水基团间的相互作用来分离蛋白质。

多元层析 (MMC) 分离蛋白质的方法与 IEX 色谱法类似。MMC 使用树脂上的带电基团，但是该基团被次级基团修饰，提供了次级相互作用，通过该作用可纯化蛋白质。

最常见的蛋白质纯化方法全部基于色谱法。基于待纯化蛋白质的属性、纯度级别和配体/化学，这些策略可以划分为四种应用类型。请注意，分离新型蛋白质或亲和色谱 (AC) 不可用时，HIC、SEC 和 IEX 有用。通过这些方法获得的纯度取决于蛋白质。离子交换和亲和色谱是部分或一步纯化中两种常用的色谱法策略。

Walker JM.2009.The Protein Protocols Handbook.Third Edition. Springer-Verlag New York, LLC