ELISA方法-ELISA技术-ELISA注意事项-赛默飞

您的 ELISA 是否正常工作？可能的问题是什么？在运行 ELISA 时，有几个步骤可能会出现潜在问题并影响结果。下面列出了最常见的问题以及可能的解决方案。

探索不同的 ELISA 故障排除问题和潜在解决方案

问题：ELISA 中信号微弱或无信号

可能的原因	溶液
试剂未在室温下开始检测时	建议在开始检测前将所有试剂均置于室温下。让试剂在工作台上放置 15 – 20 分钟，达到室温。
组分存储不正确	仔细检查试剂盒标签上的储存条件。大多数试剂盒需要在 2 –^8oC 下储存
试剂过期	确认所有试剂的有效期。请勿使用超过有效期的试剂。
试剂添加 / 制备不正确	检查方案，确保试剂按正确的顺序添加以及准备好进行正确稀释。
制备的稀释液不正确	检查移液技巧—请参阅下文以及确认计算方式。
捕获抗体与板不结合	如果使用即用型试剂盒：生产的试剂盒包括预包被捕获抗体的板子。如果使用抗体对试剂盒包被自己的板子：确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
使用的检测抗体不足	生产的试剂盒具有优化的实验方案。确保按照推荐的抗体稀释比例进行操作。如果使用抗体对试剂盒开发 ELISA ，可能需要优化检测。有关更多信息，请参见 ELISA 开发和优化。
用移液器或洗涤吸头剐蹭孔板	将分液和吸液的移入和移出孔时要小心。自动洗板机可能需要校准，因此吸头不会接触孔底部。
在错误的波长上读取了板子	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保使用推荐的波长 / 滤光片。确保针对所使用的底物类型准确设置了微孔板读数仪。

问题：ELISA 中的信号过曝

可能的原因	溶液
洗液不足	使用适当的清洗程序—请参阅下文。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上，让其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
未使用或重复使用封板膜	孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
准备的稀释液不正确	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
长孵育时间比推荐时长	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保按照推荐的培养时间进行操作。如果开发使用抗体对的 ELISA ，可能需要优化检测。请参阅ELISA开发和优化以获取更多信息。

问题：ELISA 中背景高

可能得原因	溶液
洗液不足	使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时加入 30 秒。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上并让其完全排干，如果需要，可以用力敲打以去除任何残留的液体。
底物暴露于光下优先使用	确保底物不暴露于光下—在黑暗环境中储存。进行检测时限制光暴露。
长孵育时间比推荐时长	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养时长。如果使用抗体对开发ELISA，您可能需要优化该检测方案。请参阅 ELISA 开发和优化以获取更多信息。
标准曲线不好制备的稀释液	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。

问题：ELISA 中的标准曲线差

可能得原因	溶液
标准曲线不好制备的稀释液	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
捕获抗体没有结合在板子上	确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保包被和封闭步骤的正确制备和孵育时间。

问题：ELISA 中的重复数据不良

可能的原因	溶液
洗液不足	使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时，都增加30秒。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
捕获抗体未能结合在板子上	确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
未使用或重复使用封板膜	孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。

问题：ELISA 中检测间结果不一致

可能的原因	溶液
洗液不足	使用适当的洗涤程序 - 见下文。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
不一致的孵育温度	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养温度。注意环境条件引起的温度波动。
未使用或重复使用封板膜	孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
制备的稀释液不正确	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。

问题：ELISA 的边缘效应

可能的原因	溶液
温度不均匀	在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。如果指示温度为 3 7o C ，确保培养板位于培养箱的中心。
蒸发	在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。
堆叠板	避免孵育过程中把板子堆叠起来。

信号

问题：ELISA 中信号微弱或无信号

可能的原因	溶液
试剂未在室温下开始检测时	建议在开始检测前将所有试剂均置于室温下。让试剂在工作台上放置 15 – 20 分钟，达到室温。
组分存储不正确	仔细检查试剂盒标签上的储存条件。大多数试剂盒需要在 2 –^8oC 下储存
试剂过期	确认所有试剂的有效期。请勿使用超过有效期的试剂。
试剂添加 / 制备不正确	检查方案，确保试剂按正确的顺序添加以及准备好进行正确稀释。
制备的稀释液不正确	检查移液技巧—请参阅下文以及确认计算方式。
捕获抗体与板不结合	如果使用即用型试剂盒：生产的试剂盒包括预包被捕获抗体的板子。如果使用抗体对试剂盒包被自己的板子：确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
使用的检测抗体不足	生产的试剂盒具有优化的实验方案。确保按照推荐的抗体稀释比例进行操作。如果使用抗体对试剂盒开发 ELISA ，可能需要优化检测。有关更多信息，请参见 ELISA 开发和优化。
用移液器或洗涤吸头剐蹭孔板	将分液和吸液的移入和移出孔时要小心。自动洗板机可能需要校准，因此吸头不会接触孔底部。
在错误的波长上读取了板子	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保使用推荐的波长 / 滤光片。确保针对所使用的底物类型准确设置了微孔板读数仪。

问题：ELISA 中的信号过曝

可能的原因	溶液
洗液不足	使用适当的清洗程序—请参阅下文。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上，让其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
未使用或重复使用封板膜	孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
准备的稀释液不正确	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
长孵育时间比推荐时长	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保按照推荐的培养时间进行操作。如果开发使用抗体对的 ELISA ，可能需要优化检测。请参阅ELISA开发和优化以获取更多信息。

高背景

问题：ELISA 中背景高

可能得原因	溶液
洗液不足	使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时加入 30 秒。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上并让其完全排干，如果需要，可以用力敲打以去除任何残留的液体。
底物暴露于光下优先使用	确保底物不暴露于光下—在黑暗环境中储存。进行检测时限制光暴露。
长孵育时间比推荐时长	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养时长。如果使用抗体对开发ELISA，您可能需要优化该检测方案。请参阅 ELISA 开发和优化以获取更多信息。
标准曲线不好制备的稀释液	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。

标准曲线不好

问题：ELISA 中的标准曲线差

可能得原因	溶液
标准曲线不好制备的稀释液	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
捕获抗体没有结合在板子上	确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保包被和封闭步骤的正确制备和孵育时间。

复孔数据不好

问题：ELISA 中的重复数据不良

可能的原因	溶液
洗液不足	使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时，都增加30秒。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
捕获抗体未能结合在板子上	确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
未使用或重复使用封板膜	孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。

检测的差异性

问题：ELISA 中检测间结果不一致

可能的原因	溶液
洗液不足	使用适当的洗涤程序 - 见下文。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
不一致的孵育温度	生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养温度。注意环境条件引起的温度波动。
未使用或重复使用封板膜	孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
制备的稀释液不正确	检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。

边缘效应

问题：ELISA 的边缘效应

可能的原因	溶液
温度不均匀	在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。如果指示温度为 3 7o C ，确保培养板位于培养箱的中心。
蒸发	在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。
堆叠板	避免孵育过程中把板子堆叠起来。