定量蛋白质组学

早期的生物化学蛋白质组学研究主要关注识别和理解单个蛋白质或蛋白质复合物的功能。然而，仪器技术的进步使得人们能够分析的单个样品中的蛋白质数量从几十年前的数百个增加到如今的数千个。在如此高的分析水平下，可以在细胞、组织甚至生物体水平上研究蛋白质的整体动态。这种方法与其他生命科学领域（包括基因组学、转录组学、代谢组学和激酶组学）中日益广泛使用的分析方法相一致，这些分析方法让我们对全球生物过程以及它们如何对疾病状态下的不同刺激或变化做出反应有了更深入的了解。

虽然蛋白质组学分析可用于定性识别细胞或其他生物样品中的数千种蛋白质，但还需要对这些蛋白质进行定量。由于蛋白质具有动态和交互的特性，定量蛋白质组学比简单地识别样品中的蛋白质要复杂得多。由于可以从定量蛋白质组学中获得大量数据，这种方法对于我们理解蛋白质动力学和生物过程的分子机制至关重要。

目前有两种基本的蛋白质组学分析方法。在自上而下的蛋白质组学中，完整的蛋白质或大片段被电离并通过质谱（MS）进行分析。自下而上的蛋白质组学分析依赖于肽，这些肽是通过蛋白质样品的蛋白水解产生的。由于自上而下的蛋白质组学（<50 kD）中蛋白质大小的限制，自下而上的蛋白质组学分析更常用。

由于样品中蛋白质肽的数量太多，在一次质谱分析中只能分析所有肽的一小部分，从而限制了可识别的蛋白质数量。可用于定量的蛋白质数量进一步受到限制，因为它们必须在单个实验中测试的所有样品中进行鉴定。实际上，定量的线性动态范围通常受到 10 到 20 倍的限制，具体取决于仪器的灵敏度和样品的复杂性。这种限制影响了定量蛋白质组学的范围。

蛋白质丰度和样品复杂性。蛋白质丰度和样品复杂度是影响蛋白质质量谱定量可用性的重要因素。

样品复杂度是肽段定量的一个关键因素，因为识别和定量率与样品复杂度成正比。通常采用亲和纯化等方法去除高丰度蛋白质，降低样品复杂度。内嵌式液相色谱（LC）也是常见的 MS 前分离过程，通过化学方法分离肽段，进一步降低样品复杂性。

定量蛋白质组学分析通常依赖于MS来鉴定或定量选定的肽段，尽管肽段鉴定需要串联质谱（MS/MS）。在第一轮质谱（MS1）中，电离肽被采样以产生代表样品中所有电离肽的前体离子谱。然后选择单个离子进行碰撞诱导碎裂（CID）和第二轮质谱（MS2），从而为每个前体离子产生碎片离子谱。将这些碎片离子谱与肽数据库进行比较并指定特定的肽序列，然后通过计算将其组织为预测的蛋白质序列。

MS/MS 蛋白质组学分析概述。提取样品蛋白质并将其消化成肽（A）。然后，在通过液相色谱（LC）进行化学分离之前，降低样品的复杂性（B）。然后，通过质谱（MS）分析各部分（虚线箭头所示）（C），在此期间，将肽离子化并测量其质荷比（m/z），以生成母离子谱。然后，通过碰撞诱导解离（CID）对选定的离子进行碎裂，并通过质谱仪（MS）（D）测量各个碎裂离子。然后，根据数据库比对，将碎裂离子谱图与肽序列进行匹配，并预测蛋白质序列（E）。

提高蛋白质组分析灵敏度和范围的策略通常需要大量样本和多维分馏，这会牺牲通量。另一方面，提高蛋白质定量灵敏度和通量的努力会限制可监测的特征数量。

因此，蛋白质组学研究通常分为两类：发现蛋白质组学和靶向蛋白质组学。发现蛋白质组学通过在每个样品上花费更多的时间和精力来优化蛋白质鉴定，并减少分析的样品数量。相比之下，靶向蛋白质组学策略则限制了要监测的特征数量，然后优化色谱、仪器调整和采集方法，以实现数百或数千个样品的最高灵敏度和通量。

发现蛋白质组学和靶向蛋白质组学在范围、灵敏度和可扩展性之间的平衡。由于发现蛋白质组学的广泛性和敏感性，对数百或数千个样本进行全面分析的能力是有限的。相反，靶向蛋白质组学分析需要对离散的肽子集进行定量，这使研究人员能够以最高的灵敏度分析数千个样本中的这些肽子。

发现蛋白质组学实验旨在在广泛的动态范围内识别尽可能多的蛋白质，通常需要消耗大量蛋白质、富集相关成分（例如亚细胞区室或蛋白质复合物）以及进行分馏以降低样品的复杂性（例如SDS-PAGE或色谱法）。这些策略可以减少组分之间的动态范围，并减少蛋白质或肽对电离和MS占空比时间的竞争。定量发现蛋白质组学实验带来了更大的挑战，因为它们需要识别和量化多个分馏样品中的蛋白质水平。

靶向蛋白质组学实验通常用于对不到100种蛋白质进行定量，具有极高的精度、灵敏度、特异性和通量。事实上，这种方法通常会最大限度地减少样品制备量，以提高精确度和通量。目标 MS 定量策略使用专门的工作流程和仪器来提高数百或数千个样品中有限特征的特异性和定量性，包括通过包含列表和选定的（或多个）反应监测（SRM 或 MRM）进行定向测序。

发现蛋白质组学分析通常用于盘点样品中的蛋白质或检测多个样品中蛋白质丰度的差异，而靶向定量蛋白质组学实验则越来越多地用于制药和诊断应用中，以量化复杂样品中的蛋白质和代谢物。此外，靶向蛋白质组学通常用于量化在发现筛选中发现的特定蛋白质。

特定质谱仪的特性使其更适合用于发现或靶向蛋白质组学分析。例如，由于发现蛋白质组学强调识别有限数量样品中的所有肽段，因此使用包括Thermo Scientific Orbitrap质谱分析仪在内的高分辨率仪器，以最大限度地检测具有微小质荷比（m/z）差异的肽段。相反，由于靶向蛋白质组学强调灵敏度和完整性，因此使用包括三重四极杆和离子阱在内的仪器。

质谱法本身并不具备定量功能，因为蛋白水解肽在物理化学性质上存在很大差异，这反过来又会导致不同运行之间的质谱差异。此外，质谱仪仅对样品中一小部分肽进行采样。因此，人们开发了各种方法来进行相对和绝对蛋白质组定量。

相对定量策略将样品中单个肽的水平与相同但经过实验修改的样品中的水平进行比较。相对定量的一种方法是分别用质谱分析样品，并比较其光谱，以确定一个样品中相对于另一个样品的肽丰度。这是无标记定量策略。

成本更高、耗时更长的方法需要质谱仪使用内部同位素标记标准来区分来自不同样品的相同蛋白质。使用同位素标记的典型相对定量实验需要用同位素重原子和轻原子标记两个实验样本中的蛋白质或肽（通过标记的氨基酸或细胞培养成分），这使得这两个样本中的肽成为同位素同分异构体（相同的分子，仅在同位素组成上有所不同）。

相对定量和绝对定量策略各有优缺点。

在通过化学处理或基因操作改变实验组蛋白质组后，将来自两个群体的等量蛋白质混合，并通过 LC-MS 或 LC-MS/MS 进行分析。由于单个肽的轻和重形式在化学上完全相同，它们在 LC 预分离期间共同洗脱，因此在 MS 分析期间同时被检测到。 然后比较重肽和轻肽的峰值强度，以确定一个样品相对于另一个样品的丰度变化。蛋白质或肽的同位素标记方法包括活细胞的代谢标记以及提取的蛋白质或肽的酶或化学标记。

使用同位素肽进行绝对蛋白质组定量分析时，需要在实验样品中加入已知浓度的目标肽的合成重同位素，然后进行 LC-MS/MS 分析。与使用同位素标签的相对定量法一样，化学结构相同的肽会同时洗脱，并通过质谱仪进行分析。与相对定量法不同的是，实验样品中目标肽的丰度与重肽的丰度进行比较，并使用预先确定的标准曲线反推标准物质的初始浓度，从而得出目标肽的绝对定量值。

与相对定量相比，绝对定量似乎是一种理想的方法，因为不同样品的绝对肽值也可以相互比较，以确定相对蛋白质的变化。实际上，相对蛋白质组定量比绝对定量更常用，因为对每种感兴趣的蛋白质进行绝对定量需要昂贵的试剂和耗时的检测方法开发。

实验偏差会影响使用相对或绝对定量策略的决定。产生偏差的一个原因是质谱仪本身，它对高动态范围样品中低丰度肽段的检测能力有限。此外，质谱仪的有限占空比限制了单位时间内的碰撞次数，这可能会导致复杂蛋白质样品的采样不足。

另一个偏差来源是不同实验之间或同一实验中不同样品之间样品制备的差异。标记和样品组合之间的步骤越多，引入实验偏差的风险就越大。例如，在代谢标记期间，蛋白质在活体动物或细胞中标记，然后立即将样品组合。由于所有后续样品制备和分析都是在组合样品中进行的，因此代谢标记具有最低的实验变异风险。相反，在无标记定量策略中，单独处理和分析的样本存在更大的样本变异和实验偏差风险。

定量蛋白质组学工作流程概述。该图显示了每个工作流程中为 LC-MS 分析对样本进行同位素标记（用蓝色[轻]和红色[重]表示）的时间点。无标记定量法是个例外，它需要对样品进行单独分析，并使用多种方法（光谱计数和峰强度）进行数据比较。代谢标记法的特点是对体内蛋白质进行同位素标记，然后将样品混合并处理后进行定量分析。使用同位素标记和等量标记时，蛋白质提取在标记之前进行。不过，使用同量标记，液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）分析可在质谱 1（MS1）中生成肽段离子谱，在质谱 2（MS2）中生成裂解标记谱，分别用于肽段识别和相对定量。已知重肽的数量也会被添加到未标记的样品中，并使用重肽标准曲线进行绝对定量。由于在代谢标记流程中，样品最早被标记和组合，这种方法具有最小的实验偏差风险。相相反，无标记工作流程必须严格控制，以避免偏差，因为未标记的样品是单独分析的。

相对和绝对定量无标记方法已经开发出来，作为其他定量蛋白质组学方法的快速、低成本替代方案。这些策略非常适合临床筛查或生物标记物发现实验中的大样本分析。然而，虽然它们擅长测量蛋白质表达的大变化，但测量小变化时不太可靠，线性定量测量的范围有限（<2 个数量级）。

与其他定量方法不同，无标记样品需要单独采集、制备并通过 LC-MS 或 LC-MS/MS 进行分析。因此，无标记定量实验需要比稳定同位素方法更仔细地控制，以考虑任何实验变化。蛋白质定量可通过离子峰强度或光谱计数进行。

通过离子峰强度进行相对定量仅依赖于 LC-MS（无 MS/MS）。检测所有离子的直接质谱 m/z 值，并记录其在特定时间点的信号强度。电喷雾电离产生的信号强度与离子浓度高度相关，因此可以直接根据这些峰值强度确定样品之间的相对肽水平。由于这些实验收集的数据量很大，因此需要灵敏的计算机算法进行自动离子峰对齐和比较。

无标记蛋白质定量方法。无标记蛋白质定量方法可用于测量蛋白质表达的大幅变化，且操作快速、成本低廉。

通过光谱计数进行无标记相对定量需要比较多个样品中特定肽段的 MS/MS 光谱总和，该方法已被证明与蛋白质丰度直接相关。与通过峰强度进行定量不同，光谱计数不需要特殊的算法或其他工具，但需要进行显著的归一化。

除了相对定量法，无标记方法还可用于确定样品中蛋白质的绝对浓度。一种方法是确定指数修正的蛋白质丰度指数（emPAI），该指数根据检测到的肽段数量和理论上观察到的每个蛋白质的胰蛋白酶肽段数量来估算蛋白质丰度，用于确定大规模蛋白质组分析中蛋白质的大致绝对丰度。另一种方法是绝对蛋白质表达（APEX），它基于谱计数，并使用校正因子使蛋白质丰度与观察到的肽段数量成比例。

这种体内标记的方法有很多，选择标准包括所需的标记程度。Oda 等人首次报道了用于相对蛋白质组定量分析的代谢标记法，他们通过在培养基中培养酵母，其中唯一的氮源是 ¹⁵ 标记的过硫酸铵，从而用重氮（¹⁵N）统一标记酵母中的所有氨基酸。

Mann 等人进一步发展了这一方法，将其用于哺乳动物细胞系，并报告了一种通过细胞培养中的氨基酸进行稳定同位素标记（SILAC）的方法，该方法已成为体内同位素标记的最常用方法。细胞不是在含有重氮的氨基酸培养基中培养，而是在含有 ¹³C₆-赖氨酸和/或 ¹³C₆-精氨酸的培养基中培养。之所以选择这些氨基酸，是因为用于生成蛋白质肽以供质谱分析的主要酶—胰蛋白酶，会切割赖氨酸和精氨酸的 C 末端。因此，在 SILAC 培养基中培养的所有胰蛋白酶肽（除了非常 C 末端的肽）至少有一个标记的氨基酸，这导致标记样品的质量比非标记样品（其他方面相同）的质量增加。

SILAC 工作流程。SILAC 通过在培养基中生长含有同位素重氨基酸和天然轻氨基酸的细胞来标记蛋白质样品。然后混合、提取和消化细胞裂解液。通过质谱分析，可以轻松检测蛋白质水平的差异和翻译后变化。

与其他定量方法相比，使用代谢标记策略有很多好处。首先，在 6 到 8 次传代后，蛋白质在永生化细胞系中的同位素掺入率通常可达 >90%。由于在样品制备用于质谱分析之前，重样品和轻样品是混合在一起的，因此处理误差导致的定量偏差很小。代谢标记的这一关键方面使得这种方法特别适用于检测实验条件之间蛋白质水平或翻译后修饰的相对较小变化。

这种方法的一个局限性是，一些细胞将高浓度的精氨酸转化为脯氨酸，在精氨酸标记量大的情况下，会产生两个不同的重峰簇，分别代表精氨酸或脯氨酸标记的肽。这个问题可以通过在定量计算中考虑重脯氨酸，或者通过滴定培养基中的重精氨酸浓度使其低于可检测到的转化阈值来解决。

代谢标记可能不适合难以生长或对培养基成分变化极为敏感的细胞系。由于生长条件会发生变化，以便将重化合物纳入其中，因此该技术还可能影响生物体的功能。最后，由于纳入赖氨酸和精氨酸的重同位素数量有限，因此使用代谢标记时，每次实验的实验条件数量会受到限制。例如，使用 SILAC 时，每次实验最多可以进行三种条件（未标记、¹³C₆ 标记和 ¹⁵N₄ 标记的氨基酸）。

对于不适合代谢标记的样本，例如分析临床样本（例如生物体液体、组织样本）或实验时间有限时，可使用化学或酶促稳定同位素标记方法进行定量蛋白质组分析。这些方法包括在肽或蛋白质中添加同位素原子或同位素编码标签的策略。虽然以下描述的方法并不包括同位素标记方法的详尽列表，但它们确实代表了常用的方法。

¹⁸O酶标记利用胰蛋白酶的蛋白水解机制，将两个重氧原子从 H₂¹⁸O 引入每个新消化肽的 C 端。在这种标记方案中，一个样品用胰蛋白酶和 ¹⁸O 水消化，另一个用 ¹⁶O 水消化，然后将样品混合，通过 MS 进行相对蛋白质组分析。虽然这种方法易于操作，但缺点是当两个样品混合时，¹⁸O 和 ¹⁶O 的逆向交换速度较慢，导致标记不完整或肽链仅标记一个重氧原子。虽然加入 1-5% 的甲酸可以减缓这种逆向交换长达 24 小时，但用这种方法标记的样品应快速处理。

另一种酶促同位素标记策略是全局内标技术（GIST），它使用氘代（²H）酰化剂（如 N-乙酰氧基琥珀酰亚胺（NAS））标记消化肽上的伯氨基。然而，这些基团的酰化会改变肽的离子状态，并可能影响 C 末端赖氨酸肽的离子化效率。此外，用氘标记的同位素方法会导致在液相色谱分析期间重肽和轻肽部分分离，因为氘与固定相（如 C18）有轻微相互作用。这种差异会影响内标的可信度和准确性，因为其中一个内标可能会与另一个抑制其电离的肽共同洗脱。

快速且相对廉价的化学标记方法是稳定同位素二甲基化。这种方法使用氘化水中的甲醛标记带有氘化甲基基团的一级胺。与 GIST 不同，这种方法不会改变标记肽的离子状态，因为发生了还原胺化反应，因此其化学性质与未标记肽的化学性质相同。

这种方法的好处在于，各种样品类型都可以进行甲醛固定，与其他标记试剂相比，这种方法快速且便宜。与其他标记方法一样，这种方法具有全局标记的特点，这有利有弊。当其他标记策略失败时，这种高水平的同位素标记是有益的，但它需要使用相对纯净的样品或对样品进行预处理，以降低生物样品的复杂性，从而减少质谱检测到的峰数。

市场上也有同位素标记试剂，它们包含各种反应基团，用于不同的交联剂特异性，以及用于同位素分离的不同应用的重标记。

同位素编码亲和标签（ICAT）方法旨在降低样品复杂性，识别复杂样品中的低丰度蛋白质和肽。ICAT 标签最初由一个巯基反应性化学交联基团、一个 8 倍氘代（d8；为未标记肽的分子质量增加 8 Da）或轻（d0）连接子区域和一个生物素分子组成。

由于存在巯基反应性化学基团，只有半胱氨酸残基上的游离硫醇才能被标记。然后将样品与固定化的亲和素接触，亲和素与生物素标记结合，从而从样品中纯化出标记的肽。并非所有肽都有半胱氨酸残基，因此该方法不会导致整体标记，因此只是一种降低样品复杂性的内在方法。肽段被标记后，通过固定化亲和素或链霉亲和素柱色谱法从样品中洗脱出来。纯化后，重（d8）和轻（d0）样品混合，通过 LC-MS 进行相对定量分析。

同位素编码亲和标签 (ICAT) 化学。

ICAT 标记和定量概述。（A）标签由一个与连接子区域相连的巯基反应部分组成，连接子区域带有氘或 ¹³C 取代基，使标签变重。生物素与连接子区域相连，以便对标记肽进行亲和纯化。（B）在 LC-MS 之前进行 ICAT 标记肽的纯化，可降低定量前的样品复杂性。

这种方法非常适合复杂样品，因为只有半胱氨酸残基被标记，并且标记的肽经过亲和纯化，从而大大降低了样品的复杂性。ICAT 标记确实对缺乏半胱氨酸残基的蛋白质和肽有偏见，与缺乏赖氨酸残基的蛋白质相比，这种偏差相当大。例如，14% 的大肠杆菌（E. coli）开放阅读框（ORF）不编码半胱氨酸，而只有 0.8% 不编码赖氨酸（尽管其中一半仍可能因末端胺而被标记）。在确定定量蛋白质组分析的正确同位素标记方法时，应考虑氨基酸可用性的差异。最初开发 ICAT 试剂的小组后来又开发了 ICAT 标签，其中包含 ¹³C 而不是氘，以避免 LC 期间的部分峰分离问题。

虽然 ICAT 标记肽段的亲和纯化可将样品复杂度降低 10 倍，但半胱氨酸特异性标记方法也会使蛋白质序列覆盖率降低 10 倍。由于存在这一限制，人们开发了同位素编码蛋白质标记（ICPL）方法，即用重（d4）或轻（d0）标记对完整蛋白质上的赖氨酸残基和可用的N端进行同位素标记。这种方法提高了标记水平，因为可用的末端氨基数量远远多于半胱氨酸残基。此外，与其他标记方法相比，ICPL 更适合用于 MS 前分级，因为可以在蛋白质水平（消化前；电泳或 LC）和肽水平（消化后；LC）降低样品的复杂性。ICPL 还允许在单个实验中同时比较三个实验条件，使用两个重标记（d7 和 d3）和一个轻标记（d0）。这种多重标记能力使 ICPL 区别于 ICAT 以及上述其他标记方法。

与在液相色谱洗脱过程中可能分离的同位素标签不同，同量异位素标签具有相同的质量和化学性质，允许重同位素和轻同位素异构体一起洗脱。在MS/MS 期间，标签通过碰撞诱导解离（CID）从肽段中裂解，这是这种定量蛋白质组学分析所必需的。事实上，这些标签最初被称为串联质谱标签，以表明它们与串联质谱一起使用。CID 后，对肽段碎片离子进行序列分析，并对同位素标签进行定量，从而实现肽段同时鉴定和相对定量。此外，由于需要 MS/MS 来检测同位素标签，因此未标记的肽段无法进行定量。

串联质谱标签的结构。同位素标签具有 ¹³C 和 ¹⁵N 替代基，因此质量可变。。这些差异通过连接子进行标准化，连接子的质量根据标签的质量而变化。虽然该示意图显示了 N-羟基琥珀酰亚胺（一种胺反应基团），但也可以使用巯基反应基团来标记半胱氨酸。

等量质量标签的一个优点是具有多重功能，因此这种方法具有提高通量的潜力。市售等量质量标签（例如 TMT、iTRAQ）可以同时分析 4、6 或 8 个生物样品。虽然具体使用的标签因制造商而异，但所有等量质量标签试剂的基本成分都包括一个质量报告器（标签），它具有一个唯一的¹³C 替代数；一个质量标准化器，它具有一个独特的质量，用于平衡标签的质量，使所有标签的质量相等。等量质量标签还具有反应性部分，可与伯胺或半胱氨酸（取决于所使用的产品）交联。这些标签的设计使得在 CID（HCD）高能碰撞时，质量标签在特定的连接区域断裂，产生不同大小的标签，然后通过 LC-MS/MS 进行定量。等量质量标记也适用于蛋白质标记（类似于 ICPL）。一些市售试剂盒还提供具有巯基反应性和抗TMT抗体的等量标记，用于在 LC-MS/MS 之前亲和纯化半胱氨酸标记的肽段。

多重蛋白质组定量示例。样品用单独的质量标签标记，然后合并进行 LC-MS/MS 分析。由于所有标签的质量相同，来自不同样品的相同肽段共同洗脱，并通过 MS 进行分析。 在 HCD 诱导的标签裂解和另一轮 MS 之后，标签用于定量相对肽段强度，而肽段碎片离子则用于蛋白质鉴定。

选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）是一种靶向蛋白质组学分析中的绝对定量（AQUA）方法，通过在复杂样品中添加稳定同位素标记的合成肽段作为特定肽段的内标来实现。这些重肽与样品消化产生的胰蛋白酶肽完全相同，因此它们与目标肽共同洗脱，并通过 MS/MS（使用具有较大动态范围的仪器）同时进行分析。然后通过测量目标肽相对于重肽的观测信号响应来确定目标肽的浓度，重肽的浓度根据预先确定的校准响应曲线计算得出。虽然这种方法只需一个样品即可得出肽段的绝对浓度，但必须为样品中的每个目标肽段生成校准曲线。

测定方法的开发是 SRM 蛋白质组学分析的重要组成部分。必须合成每个目标肽段的重肽，由于蛋白质会产生具有不同电化学特性的多种肽段，因此必须确定能够产生最佳结果的重肽序列。软件可用于预测理想的胰蛋白酶肽序列，但肽识别和仪器优化的反复试验相结合，使得使用同位素肽的绝对定量既耗时又昂贵。然而，一旦针对预定肽组（每次液相色谱-质谱联用最多约 200 个）优化了测定方法，SRM 在检测多个样品中的这些肽时就能提供最高水平的重现性和灵敏度。据报道，这种方法可以检测未分馏裂解液中浓度低于每细胞 50 个拷贝的蛋白质，这表明定量方法受样品复杂性影响最小。

AQUA 级肽因其高质量和高纯度而价格昂贵，因此科学家在开发目标检测方法时经常使用低质量的粗肽。在检测方法开发过程中，可以商业合成和筛选整个不同肽序列的文库，以确定最佳肽，然后按照 SRM 检测方法的纯度和质量标准进行合成。

使用重肽进行靶向检测方法开发和定量概述。

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