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定量蛋白印迹分析
实现灵敏的化学发光定量蛋白印迹法的关键步骤
传统的蛋白印迹法可用于检测裂解液或复杂混合物中是否存在特定蛋白。此外，它还可以对蛋白质表达水平在刺激或干预下的变化进行定性评估。蛋白印迹法不再局限于生成定性数据，还可以用于评估这些表达差异的大小。然而，由于信号饱和和样本之间变异的标准化化不理想，仅使用当前的密度测定技术来量化表达差异可能会产生误导。出版商们同意—近年来，一些期刊在定量报告方法上采用了更严格的标准 [1,2]。在此，我们将讨论有效的化学发光定量蛋白印迹分析所需的关键参数，以生成更准确的数据，并减少因优化而丢失的印迹数量。
定量蛋白印迹中的标准化
为了准确评估目标丰度的差异，需要进行标准化。标准化可纠正蛋白印迹法过程中不可避免的错误，包括样品加载或电泳、转移或样品浓缩的影响。为定量蛋白印迹法选择正确的标准化方法对于获得可靠且可重复的结果至关重要。当您的蛋白印迹实验从定性分析过渡到定量分析时，需要考虑的最重要的属性是信号饱和度。当化学发光信号饱和时，信号强度与蛋白质丰度之间的相关性就会丧失。图 1 显示了一些常见的标准化对照，称为内参蛋白（HKPs）。它们包括 β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和 α-微管蛋白，这些蛋白在常见的裂解液负载量（例如30-50 μg克/孔）下会达到饱和。相对强度呈非线性变化并趋于平稳，表明蛋白质含量越高，强度几乎相同。重要的是，要避免在标准化对照以及目标蛋白中出现信号饱和，否则将无法进行精确定量。通通过适当的计算，可以将样品信号精确标准化为指定为内部加载对照的内参蛋白，以获得定量蛋白印迹数据。在所有实验条件下，精确的加载对照应显示样品加载量和信号强度之间的线性关系。
另一种越来越受欢迎的标准化方法是总蛋白标准化（TPN），它用每个泳道中加载的总蛋白量来标准化目标信号。一种 TPN 方法是使用 Invitrogen 无染色蛋白标记试剂，该试剂用荧光标记共价标记每个泳道中加载的总蛋白。标记后，总蛋白可用于归一化目标蛋白的信号。图 1 显示了使用无染色蛋白标记试剂替代传统HKP的优势，因为传统 HKP 很容易过饱和。无染色蛋白标记试剂提供了具有宽动态范围的线性响应曲线，从而实现精确归一化。
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图 1.使用无染色蛋白标记试剂进行总蛋白标准化。在较高蛋白负荷下，无染色蛋白标记试剂在信号线性度方面优于普通内参蛋白。方法： Invitrogen Bolt 4–12% Bis-Tris Plus 凝胶中每条泳道加入 10–50 μg 的 HeLa 总蛋白裂解液，使用 MES 缓冲液进行电泳。使用带有 iBlot 2 转移堆栈的 Invitrogen iBlot 2 凝胶转移装置将凝胶中的蛋白质转移到小型 PVDF 膜上（P0 方案，7 分钟）。用 20 ml 超纯水对膜进行 2 次清洗，每次 2 分钟，然后用 10 ml 无染色蛋白标记试剂工作液标记10分钟。然后，用 20 ml 超纯水对膜进行 3 次、每次 2 分钟的清洗，接着加入 Invitrogen 的一抗，包括 β-actin（目录号：AM4302）、GAPDH（目录号： 398600)、α-微管蛋白号 AM4302）、GAPDH（货号号 398600）和 α-tubulin（货（目录号：138000）和 Invitrogen 山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 680 二抗（目录号：A21058）。所示印迹使用 Invitrogen iBright 成像系统成像，并使用 Invitrogen iBright 分析软件对泳道中的总蛋白信号进行定量。整个总蛋白信号范围的绘图数据的 R² 为0.9990，而 β-肌动蛋白、GAPDH 和 α-微管蛋白的R² 分别为 0.8851、0.9438 和 0.8332。
避免定量蛋白印迹法的常见陷阱
一旦有了适当的标准化技术，传统的蛋白印迹法还需要一些额外的优化，才能提供真正的定量结果。我们已经确定了三个对定量蛋白印迹法影响最大的参数，并制定了详细的策略来对其进行适当的优化。
1.优化蛋白质加载
导致信号饱和的最常见问题是在凝胶孔中加入过多的蛋白质样品。根据目标蛋白质的丰度优化蛋白质的加载量非常重要，这样可以避免信号饱和。高丰度蛋白质（如 HSP90）在裂解液加载量超过3 μ g 时容易饱和。低丰度和中等丰度的蛋白质（如p23）在裂解液负载量达到 20 μg时，检测结果呈线性。低丰度目标（如 Ras10）的检测结果在裂解液负载量达到 40 μg克时呈线性（图 2）。为了在大多数蛋白印迹法中获取线性信号，我们建议每孔加载 1 至 10 μg 较少的蛋白质样品。为了避免样品过少或过多，请在电泳前使用兼容的蛋白质测定法确定每个样品的蛋白质浓度。为了快速、准确地定量蛋白质，我们推荐使用 Invitrogen Qubit Protein BR 测定法或 Thermo Scientific Pierce Rapid Gold BCA 蛋白质测定法。
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图2.样品负荷与条带强度之间的线性关系基于蛋白质目标丰度。高丰度蛋白质（如 HSP90 和 μ-钙蛋白酶）仅在 1 至 3 μg裂解液负荷下才显示线性信号，而中低丰度蛋白质在高达10微克的裂解液负荷下显示线性信号。将 A431 或 A549 细胞裂解液从 10 μg/孔开始连续稀释3倍，然后加载到 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶上，在 200 V 电压下电泳 20 分钟。使用 iBlot 2 凝胶转移装置（P0，7 分钟）将凝胶转印到硝酸纤维素膜上。免疫印迹处理使用 Invitrogen Bandmate 自动蛋白印迹仪（目录号：BW1000）进行。将膜封闭在 Thermo Scientific Pierce 1X 透明牛奶阻滞缓冲液（目录号：37587）中。使用 1X 透明牛奶阻滞缓冲液稀释的 Invitrogen一抗检测每张膜：小鼠抗 p23（1:20,000，目录号：MA3-414）、兔抗HSP90（1:25,000， 目录号：PA3-013）、小鼠抗泛 Ras10（1:5,000，目录号：MA1-012）或小鼠抗 mu-calpain（1:5,000，目录号：MA3-940）。二抗孵育使用 Invitrogen HRP 结合的羊抗兔 IgG（1:50,000，目录号：32460）或羊抗小鼠 IgG（目录号：32430）中。使用 Thermo Scientific SuperSignal West Dura 延时底物（目录号：34076）中。在iBright 成像系统上对膜成像。
2.优化抗体稀释度
一抗和二抗的浓度都会导致化学发光蛋白印迹法中的非线性饱和信号。在蛋白印迹法中加入过多的酶结合物或二抗是导致信号变化、高背景、信号持续时间短和灵敏度低的主要原因之一。虽然抗体稀释的重要性不及确保适当的裂解液量，但最佳抗体浓度可将您的印迹从半定量提升至完全定量（图 3）。如果您遇到信号饱和问题，我们建议您稀释一抗和二抗。在大多数情况下，稀释是有一定好处的，特别是对于高丰度目标。然而，过度稀释会导致最低目标浓度下的检测限略有降低。重要的是尝试几种不同的稀释组合，以了解哪种稀释最适合您的实验。
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图 3.一抗和二抗的正确稀释可以提高信号的线性度。当一抗从 1:500 稀释到 1:5000（A 到 B）以及二抗从 1:50000 稀释到 1:250000（A 到 C）时，信号变得更加线性。当两者都稀释时（D），可获得最大的线性。方法：将 A549 细胞裂解液以10 μg/孔的浓度进行 3 倍稀释，然后加载到 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶上，在 200 伏电压下电泳约 20 分钟。使用 iBlot 2 凝胶转移装置将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上（P0 方案，7 分钟）。使用 Bandmate 自动蛋白印迹仪进行免疫印迹处理。用1X透明牛奶封闭液封闭膜。用 Invitrogen 兔抗环蛋白 B（目录号：PA1-027A）号在 1X 透明牛奶封闭缓冲液中以 1:500 或 1:5000 稀释，对 4 个膜进行检测 ，然后与 HRP 结合的羊抗兔 IgG（目录号：32460）孵育，稀释度为 1:50,000 或 1:250,000。使用SuperSignal West Dura 延时底物进行化学发光检测。在iBright 成像系统上对膜成像。
3.优化化学发光信号
最后需要避免的一个常见错误是选择不兼容或性能不佳的化学发光 HRP 底物。超灵敏化学发光底物正在突破灵敏度的极限，这对于检测低丰度蛋白非常重要。然而，对于高或中等丰度目标，超灵敏底物可能会导致信号饱和，从而无法进行定量。在光谱的另一端，标准 ECL 底物可能不够灵敏，无法检测中低丰度蛋白靶标。定量化学发光蛋白印迹法需要一种最佳底物，能够在广泛的蛋白浓度范围内提供灵敏的线性信号。为了获得最可靠、最可重复的定量结果，应选择一种具有宽动态范围、灵敏检测和长半衰期的底物。Thermo Scientific SuperSignal West Dura延时底物是此类应用的理想选择。该底物在定量应用中表现出色，原因在于以下特性：
更高的线性度—SuperSignal West Dura 底物对高丰度和低丰度蛋白质均表现出线性度。与高灵敏度底物（如 Thermo Scientific SuperSignal West Atto 超敏底物）相比，它不太可能因高丰度蛋白质靶标而过度饱和，而高灵敏度底物则需要仔细优化。然而，它仍然足够灵敏，可以检测低至中飞克级的低丰度蛋白。SuperSignal West Dura 底物在高（Akt、E-cadherin）、中（p23）和低（Ras10）丰度蛋白中提供线性信号（图 4）。
图 4.SuperSignal West Dura 底物为高、中、低丰度目标提供线性信号，相关系数为 R²>0.99。稀释系列 A549 细胞裂解液（起始浓度为 10 μg/孔或 2.5 μg/孔）被加载到 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶上，并在 200 V 电压下电泳约 20 分钟。使用 iBlot 2 凝胶转移装置（P0 方案，7 分钟）将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上。使用 Bandmate 自动蛋白印迹仪进行免疫印迹处理。用1X透明牛奶封闭液封闭膜。用1X 透明牛奶封闭液稀释的单抗一抗检测膜，包括小鼠抗泛 Ras10（1:5,000，目录号：MA1-012）、小鼠抗 p23（1:20,000，目录号：MA3-414），兔抗 E-钙粘蛋白（1:25,000，目录号：MA5-29711）或兔抗 Akt（1:2,000，目录号：44-609G）。 随后用 HRP 结合的羊抗小鼠 IgG（1:25,000 或 1:250,000，目录号：32430）或羊抗兔 IgG（1:25,000，目录号：32460）进行孵育。使用SuperSignal West Dura 延时底物进行化学发光检测。在 iBright 成像系统上对膜进行成像。
一致的线性信号—SuperSignal West Dura 底物以其在长时间内提供稳定信号的能力而闻名。将印迹放置在此基质中较长时间不会导致高丰度或低丰度波段之间的光产生率不同，且数据保持线性（图 5）。
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图 5.SuperSignal West Dura 底物可长时间保持稳定的线性信号。。将 A549 细胞裂解液以 3 倍稀释系列的形式（起始浓度为 20 μg/孔）加载到 Bolt 4–12% Bis-Tris Plus 凝胶上，并在 200 V 电压下电泳约 20 分钟。使用 iBlot 2 凝胶转移装置（P0 方案，7 分钟）将凝胶转印到硝酸纤维素膜上。使用 Bandmate 自动蛋白印迹仪进行免疫印迹处理。将膜用 1X 透明牛奶封闭液封闭，然后用 1:5000 稀释的小鼠抗泛 Ras10（目录号：MA1-012）进行检测，接着用 HRP 结合的羊抗小鼠 IgG（1:100000，目录号：32430）进行孵育。使用 SuperSignal West Dura 底物进行化学发光检测。将膜置于保护片内，以便在不使印迹变干的情况下进行多次图像采集。在加入底物后的不同时间点（初始、15 分钟、60 分钟、120 分钟）在 iBright 成像系统上对膜进行成像，以跟踪信号衰减。每张图像使用相同的曝光时间。
高灵敏度—SuperSignal West Dura 底物（图 6）能够检测低至中飞克级的蛋白质。这提供了足够的灵敏度来检测低丰度蛋白质，并能够在检测中高丰度蛋白质时使用较低浓度的抗体。
图 6.SuperSignal West Dura 底物为蛋白印迹法检测提供了灵敏、强烈的信号。将 1:1 稀释系列的 HeLa 细胞裂解液（起始浓度为 20 μg/孔）加载到凝胶上，并使用 Invitrogen Power Blotter XL 系统（目录号：PB0013）转移到硝酸纤维素膜上。用 Invitrogen 小鼠抗 STAT3（目录号：MA1-13042）和 HRP 结合物山羊抗小鼠 IgG（目录号：31430）对膜进行检测。使用 SuperSignal West Dura 底物或 Thermo Scientific Pierce ECL 蛋白印迹法底物进行化学发光检测。
结论
随着研究人员和出版商逐渐认识到当前密度测定技术的不足，蛋白质生物学实验室正在从定性蛋白印迹法向定量蛋白印迹法转变（图 7）。为了采用这种更精确的新技术，需要调整当前的蛋白印迹法。除了采用总蛋白标准化作为首选标准化方法外，我们还建议解决本技术注释中讨论的三个参数：
- 减少凝胶上加载的裂解液量，以限制信号饱和。我们建议每孔加载 1 至 10 μg 的蛋白质。
- 优化一抗和二抗的稀释度。在大多数情况下，这意味着减少所用抗体的总量（更高稀释度）。这将限制系统中的 HRP 量，以防止信号饱和。
- 使用优化的化学发光底物，如 SuperSignal West Dura 底物。SuperSignal West Dura 底物具有多功能性、稳定性和宽动态范围，是生成线性数据的绝佳选择。
图 7.在 PubMed™ 搜索“定量蛋白印迹法”。定量蛋白印迹法分析的使用率越来越高。过去十年中，该术语的搜索量呈指数级增长。数据来自 PubMed 搜索引擎。检索日期：2021年4月27日。
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参考文献
其他资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。