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良好的样品制备对于在电泳和 Western 印迹检测中成功分离蛋白条带至关重要。由于蛋白质样品的多样性,因此,没有单一样品制备方法或缓冲液适用于所有类型的样品。然而,以下通用指南和方案应在制备用于蛋白电泳和后续蛋白免疫印迹分析的样品时提供良好的起点。
细胞裂解缓冲液 (关于推荐信息,请参见下表) | 上样缓冲液(上样缓冲液)(例如LDS 上样缓冲液,4x,货号 NP0007) |
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(例如 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物,货号 78440 或 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,货号 A32961) | 可选:样品还原剂(例如 NuPAGE 样品还原剂 (10X),货号 NP0004) |
冰磷酸盐缓冲液 (PBS)(例如磷酸盐缓冲液干粉包,货号 28372) | 进行非变性 PAGE:非变性上样缓冲液(例如 Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液,货号 LC2673) |
蛋白定量(例如 Pierce BCA 蛋白定量,货号No 23225) |
靶蛋白位置 | 推荐缓冲液 | 描述 |
---|---|---|
全细胞 (总蛋白提取)(温和裂解缓冲液,以保留蛋白质-蛋白质相互作用) | M-PER 哺乳动物总蛋白提取试剂 | 25mM N-二羟乙基甘氨酸缓冲液 (pH 7.6) 中的非变性去垢剂 |
全细胞(总蛋白提取)(蛋白为膜结合蛋白、核蛋白或线粒体蛋白) | RIPA 裂解缓冲液 | 25 mM Tris-HCl pH 7.6 150 mM NaCl 1% NP-40 或 Triton X-100 1% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS |
胞质 | NP-40 细胞裂解缓冲液 | 50 mM Tris, pH 7.4 250 mM NaCl 5 mM EDTA 50 mM NaF 1 mM Na3VO4 1% NP-40 |
如果使用非哺乳动物细胞,则要探索推荐的样品类型特异性 裂解缓冲液。
1.通过添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂制备裂解缓冲液。如果使用 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 100x,则直接向细胞裂解缓冲液中加入 10 µL/mL 的混合物。如果使用 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,请将片剂从小瓶中取出,放入 10 mL 裂解缓冲液,然后涡旋溶解。可选:若要抑制金属蛋白酶,请在 10 µL/mL 裂解缓冲液中加入 EDTA (0.5 M)。 |
2.将细胞培养皿放在冰上,小心移除培养基,并使用冰 PBS 洗涤细胞。 |
3.吸出 PBS,加入冰裂解缓冲液 (每 107 个细胞或 100 mm 反应板约 1 mL;60 mm 反应板约 0.5 mL;6 孔培养板约 200-400 μL)。轻轻摇动或在冰上涡旋 5 分钟。或者:在微量离心管中重悬裂解缓冲液前,可让细胞胰蛋白酶化,并用 PBS 洗涤。 |
4.收集细胞裂解液,并将其转移至微量离心管中。将样品以 ~14,000×g 离心 15 分钟,收集细胞碎屑。 |
5.将上清液转移到新的微量离心管中并丢弃沉淀。 |
2.以 2,500×g 离心 10 分钟,收集细胞。丢弃上清液。 |
3.将细胞沉淀重新悬浮于冰 PBS 中,细胞洗涤一次。以 2,500×g 离心 10 分钟,收集细胞。 |
4.加入冰裂解缓冲液(每 100 mg 约 1 mL 或细胞沉淀反应孔约 100 µL)。将混合物向上和向下移液以重悬沉淀。 |
5.轻轻摇动混合物 10 分钟。以 ~14,000×g 离心 15 分钟,移除细胞碎屑。 |
6.将上清液转移至新的微量离心管中,并丢弃沉淀。 |
7.制备稀释的白蛋白 (BSA) 标准品。或者:使用 预稀释的 BSA 标准品。 |
8.将 BCA 试剂 A 的 50 个部分与 BCA 试剂 B 的 1 个部分混合(试剂 A:B 为 50:1)来制备工作试剂。 |
9.用移液管吸取 25 µL 标准品或未知样品复本,加入微孔板孔(工作范围 = 20-2000 µg/mL)。 |
10.向每个孔中加入 200 µL 工作试剂,并在微孔板振荡器上充分混合 30 秒。 |
11.盖上微孔板,在 37℃ 下孵育 30 分钟。 |
12.将微孔板冷却至室温。在酶标仪上测量 562 nm 处或附近的吸光度。 |
13.测定蛋白浓度。 |
BCA 蛋白检测相比 Bradford 检测法(基于考马斯染料的检测方法)具有独特的优势,因为它们可以兼容包含多达 5% 去垢剂的样品,并且受蛋白组成差异的影响小得多,从而提供了更大的蛋白间一致性和定量准确性。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
---|---|---|
蛋白样本 | x μL | x μL |
SDS/LDS 上样缓冲液 (4X)* | 2.5 μL | 2.5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
在含 SDS 的缓冲液中于 100℃ 下加热样品可能导致蛋白质水解。我们建议,在 70℃ 下加热用于变性电泳(还原或非还原状态)的样品 2–10 分钟,以获得理想的结果。切勿加热用于非变性 (native) 电泳的样品。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
---|---|---|
蛋白样本 | x μL | x μL |
非变性上样缓冲液 (2X) | 5 μL | 5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
细胞裂解缓冲液(关于推荐信息,请参见下表) | 上样缓冲液(上样缓冲液)(例如LDS 上样缓冲液,4x,货号 NP0007) |
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(例如 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物,货号 78440 或 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,货号 A32961) | 可选:样品还原剂(例如 NuPAGE 样品还原剂 (10X),货号 NP0004) |
冰磷酸盐缓冲液 (PBS)(例如磷酸盐缓冲液干粉包,货No 28372) | 进行非变性 PAGE:非变性上样缓冲液(例如 Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液,货号 LC2673) |
蛋白定量 (例如 Pierce BCA 蛋白定量,货号No 23225) |
靶蛋白位置 | 建议缓冲液 | 说明 |
---|---|---|
全细胞 (总蛋白提取) | T-PER 组织蛋白提取试剂 (温和裂解缓冲液,以保留蛋白质-蛋白质相互作用并尽可能减少变性) | 含非变性去垢剂的 25 mM N-二羟乙基甘氨酸缓冲液,150 mM 氯化钠 (pH 7.6) |
全细胞(总蛋白提取)(蛋白为膜结合蛋白、核蛋白或线粒体蛋白) | RIPA 裂解缓冲液 (含有经典的去垢剂,以帮助将蛋白引入溶液) | 25 mM Tris-HCl pH 7.6 150 mM NaCl 1% NP-40 或 Triton X-100 1% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS |
1.通过添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂制备裂解缓冲液。如果使用 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 100x,则直接向细胞裂解缓冲液中加入 10 µL/mL 的混合物。如果使用 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,请将片剂从小瓶中取出,放入 10 mL 裂解缓冲液,然后涡旋溶解。可选:若要抑制金属蛋白酶,请在 10 µL/mL 裂解缓冲液中加入 EDTA (0.5 M)。 |
2.在冰上解剖目标组织并称量样品。使用约 50 mg 组织与 1000 µL 冰裂解缓冲液的比值。如果需要浓度更高的蛋白提取物,请使用较少量的裂解缓冲液。 |
3.向组织样品中加入适量的冰裂解缓冲液,并在冰上匀浆。 |
4.将样品以 10,000×g 离心 5 分钟,收集细胞/组织碎屑。 |
5.将上清液转移至新的微量离心管中,并丢弃沉淀。 |
6.制备稀释的白蛋白 (BSA) 标准品。或者:使用 预稀释的 BSA 标准品。 |
7.将 BCA 试剂 A 的 50 个部分与 BCA 试剂 B 的 1 个部分混合来制备工作试剂(试剂 A:B 为 50:1)。 |
8.用移液管吸取 25 µL 标准品或未知样品复本,加入微孔板孔(工作范围 = 20-2,000 µg/mL)。 |
9.向每个孔中加入 200 µL 工作试剂,并在微孔板振荡器上充分混合 30 秒。 |
10.盖上微孔板,在 37℃ 下孵育 30 分钟。 |
11.将微孔板冷却至室温。在酶标仪上测量 562 nm 处或附近的吸光度。 |
12.测定每种细胞裂解物的蛋白浓度。测定蛋白的上样量(推荐 50 μL/孔)。 |
BCA 蛋白检测相比 Bradford 检测法(基于考马斯染料的检测方法)具有独特的优势,因为它们可以兼容包含多达 5% 去垢剂的样品,并且受蛋白组成差异的影响小得多,从而提供了更大的蛋白间一致性和定量准确性。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
---|---|---|
蛋白样本 | x μL | x μL |
SDS/LDS 上样缓冲液 (4X)* | 2.5 μL | 2.5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
* 对于 Tricine 凝胶,推荐使用 Tricine SDS 上样缓冲液。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
---|---|---|
蛋白样本 | x μL | x μL |
非变性样品缓冲液 (2X) | 5 μL | 5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
在含 SDS 的缓冲液中于 100℃ 下加热样品可能导致蛋白质水解。我们建议,在 70℃ 下加热用于变性电泳(还原或非还原状态)的样品 2–10 分钟,以获得理想的结果。请勿加热用于非变性 (native) 电泳的样品。
请勿储存还原样品。制备样品储备液(如示例表,还原剂除外),并将其储存在 -20ºC 或 -80ºC 温度下。使用前使用还原剂 (10X) 还原样品。
细胞裂解缓冲液 (关于推荐信息,请参见下表) | 上样缓冲液(上样缓冲液)(例如LDS 上样缓冲液,4x,货号 NP0007) |
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(例如 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物,货号 78440 或 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,货号 A32961) | 可选:样品还原剂(例如 NuPAGE 样品还原剂 (10X),货号 NP0004) |
冰磷酸盐缓冲液 (PBS)(例如磷酸盐缓冲液干粉包,货号 28372) | 进行非变性 PAGE:非变性上样缓冲液(例如 Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液,货号 LC2673) |
蛋白定量(例如 Pierce BCA 蛋白定量,货号No 23225) |
靶蛋白位置 | 推荐缓冲液 | 描述 |
---|---|---|
全细胞 (总蛋白提取)(温和裂解缓冲液,以保留蛋白质-蛋白质相互作用) | M-PER 哺乳动物总蛋白提取试剂 | 25mM N-二羟乙基甘氨酸缓冲液 (pH 7.6) 中的非变性去垢剂 |
全细胞(总蛋白提取)(蛋白为膜结合蛋白、核蛋白或线粒体蛋白) | RIPA 裂解缓冲液 | 25 mM Tris-HCl pH 7.6 150 mM NaCl 1% NP-40 或 Triton X-100 1% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS |
胞质 | NP-40 细胞裂解缓冲液 | 50 mM Tris, pH 7.4 250 mM NaCl 5 mM EDTA 50 mM NaF 1 mM Na3VO4 1% NP-40 |
如果使用非哺乳动物细胞,则要探索推荐的样品类型特异性 裂解缓冲液。
1.通过添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂制备裂解缓冲液。如果使用 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 100x,则直接向细胞裂解缓冲液中加入 10 µL/mL 的混合物。如果使用 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,请将片剂从小瓶中取出,放入 10 mL 裂解缓冲液,然后涡旋溶解。可选:若要抑制金属蛋白酶,请在 10 µL/mL 裂解缓冲液中加入 EDTA (0.5 M)。 |
2.将细胞培养皿放在冰上,小心移除培养基,并使用冰 PBS 洗涤细胞。 |
3.吸出 PBS,加入冰裂解缓冲液 (每 107 个细胞或 100 mm 反应板约 1 mL;60 mm 反应板约 0.5 mL;6 孔培养板约 200-400 μL)。轻轻摇动或在冰上涡旋 5 分钟。或者:在微量离心管中重悬裂解缓冲液前,可让细胞胰蛋白酶化,并用 PBS 洗涤。 |
4.收集细胞裂解液,并将其转移至微量离心管中。将样品以 ~14,000×g 离心 15 分钟,收集细胞碎屑。 |
5.将上清液转移到新的微量离心管中并丢弃沉淀。 |
2.以 2,500×g 离心 10 分钟,收集细胞。丢弃上清液。 |
3.将细胞沉淀重新悬浮于冰 PBS 中,细胞洗涤一次。以 2,500×g 离心 10 分钟,收集细胞。 |
4.加入冰裂解缓冲液(每 100 mg 约 1 mL 或细胞沉淀反应孔约 100 µL)。将混合物向上和向下移液以重悬沉淀。 |
5.轻轻摇动混合物 10 分钟。以 ~14,000×g 离心 15 分钟,移除细胞碎屑。 |
6.将上清液转移至新的微量离心管中,并丢弃沉淀。 |
7.制备稀释的白蛋白 (BSA) 标准品。或者:使用 预稀释的 BSA 标准品。 |
8.将 BCA 试剂 A 的 50 个部分与 BCA 试剂 B 的 1 个部分混合(试剂 A:B 为 50:1)来制备工作试剂。 |
9.用移液管吸取 25 µL 标准品或未知样品复本,加入微孔板孔(工作范围 = 20-2000 µg/mL)。 |
10.向每个孔中加入 200 µL 工作试剂,并在微孔板振荡器上充分混合 30 秒。 |
11.盖上微孔板,在 37℃ 下孵育 30 分钟。 |
12.将微孔板冷却至室温。在酶标仪上测量 562 nm 处或附近的吸光度。 |
13.测定蛋白浓度。 |
BCA 蛋白检测相比 Bradford 检测法(基于考马斯染料的检测方法)具有独特的优势,因为它们可以兼容包含多达 5% 去垢剂的样品,并且受蛋白组成差异的影响小得多,从而提供了更大的蛋白间一致性和定量准确性。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
---|---|---|
蛋白样本 | x μL | x μL |
SDS/LDS 上样缓冲液 (4X)* | 2.5 μL | 2.5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
在含 SDS 的缓冲液中于 100℃ 下加热样品可能导致蛋白质水解。我们建议,在 70℃ 下加热用于变性电泳(还原或非还原状态)的样品 2–10 分钟,以获得理想的结果。切勿加热用于非变性 (native) 电泳的样品。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
---|---|---|
蛋白样本 | x μL | x μL |
非变性上样缓冲液 (2X) | 5 μL | 5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
细胞裂解缓冲液(关于推荐信息,请参见下表) | 上样缓冲液(上样缓冲液)(例如LDS 上样缓冲液,4x,货号 NP0007) |
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(例如 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物,货号 78440 或 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,货号 A32961) | 可选:样品还原剂(例如 NuPAGE 样品还原剂 (10X),货号 NP0004) |
冰磷酸盐缓冲液 (PBS)(例如磷酸盐缓冲液干粉包,货No 28372) | 进行非变性 PAGE:非变性上样缓冲液(例如 Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液,货号 LC2673) |
蛋白定量 (例如 Pierce BCA 蛋白定量,货号No 23225) |
靶蛋白位置 | 建议缓冲液 | 说明 |
---|---|---|
全细胞 (总蛋白提取) | T-PER 组织蛋白提取试剂 (温和裂解缓冲液,以保留蛋白质-蛋白质相互作用并尽可能减少变性) | 含非变性去垢剂的 25 mM N-二羟乙基甘氨酸缓冲液,150 mM 氯化钠 (pH 7.6) |
全细胞(总蛋白提取)(蛋白为膜结合蛋白、核蛋白或线粒体蛋白) | RIPA 裂解缓冲液 (含有经典的去垢剂,以帮助将蛋白引入溶液) | 25 mM Tris-HCl pH 7.6 150 mM NaCl 1% NP-40 或 Triton X-100 1% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS |
1.通过添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂制备裂解缓冲液。如果使用 Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 100x,则直接向细胞裂解缓冲液中加入 10 µL/mL 的混合物。如果使用 Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂,请将片剂从小瓶中取出,放入 10 mL 裂解缓冲液,然后涡旋溶解。可选:若要抑制金属蛋白酶,请在 10 µL/mL 裂解缓冲液中加入 EDTA (0.5 M)。 |
2.在冰上解剖目标组织并称量样品。使用约 50 mg 组织与 1000 µL 冰裂解缓冲液的比值。如果需要浓度更高的蛋白提取物,请使用较少量的裂解缓冲液。 |
3.向组织样品中加入适量的冰裂解缓冲液,并在冰上匀浆。 |
4.将样品以 10,000×g 离心 5 分钟,收集细胞/组织碎屑。 |
5.将上清液转移至新的微量离心管中,并丢弃沉淀。 |
6.制备稀释的白蛋白 (BSA) 标准品。或者:使用 预稀释的 BSA 标准品。 |
7.将 BCA 试剂 A 的 50 个部分与 BCA 试剂 B 的 1 个部分混合来制备工作试剂(试剂 A:B 为 50:1)。 |
8.用移液管吸取 25 µL 标准品或未知样品复本,加入微孔板孔(工作范围 = 20-2,000 µg/mL)。 |
9.向每个孔中加入 200 µL 工作试剂,并在微孔板振荡器上充分混合 30 秒。 |
10.盖上微孔板,在 37℃ 下孵育 30 分钟。 |
11.将微孔板冷却至室温。在酶标仪上测量 562 nm 处或附近的吸光度。 |
12.测定每种细胞裂解物的蛋白浓度。测定蛋白的上样量(推荐 50 μL/孔)。 |
BCA 蛋白检测相比 Bradford 检测法(基于考马斯染料的检测方法)具有独特的优势,因为它们可以兼容包含多达 5% 去垢剂的样品,并且受蛋白组成差异的影响小得多,从而提供了更大的蛋白间一致性和定量准确性。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
---|---|---|
蛋白样本 | x μL | x μL |
SDS/LDS 上样缓冲液 (4X)* | 2.5 μL | 2.5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
* 对于 Tricine 凝胶,推荐使用 Tricine SDS 上样缓冲液。
试剂名称 | 还原样品 | 非还原样品 |
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蛋白样本 | x μL | x μL |
非变性样品缓冲液 (2X) | 5 μL | 5 μL |
还原剂 (10X) | 1 μL | — |
去离子水 | 加至 10 μL | 加至 10 μL |
总容量 | 10 μL* | 10 μL* |
在含 SDS 的缓冲液中于 100℃ 下加热样品可能导致蛋白质水解。我们建议,在 70℃ 下加热用于变性电泳(还原或非还原状态)的样品 2–10 分钟,以获得理想的结果。请勿加热用于非变性 (native) 电泳的样品。
请勿储存还原样品。制备样品储备液(如示例表,还原剂除外),并将其储存在 -20ºC 或 -80ºC 温度下。使用前使用还原剂 (10X) 还原样品。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。