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使用已发表的抗体和试剂 盒快速启动您的实验设计
由 Roederer 和 Tarnok [1]提出的优化多色免疫荧光试剂盒（OMIP）是指经过全面测试和验证的一组抗体和试剂，可用于对特定细胞状态或反应进行多色表征或评估。例如，OMIP-001 经过优化，可用于评估抗原反应性人类T细胞的质量和表型[2]；OMIP-009 经过优化，可用于表征人类T细胞的免疫反应 [3]。
在《细胞计量学 A 部分》杂志（Wiley 在线图书馆）上发表的首批 OMIP 是为流式细胞术设计的，但 OMIP 也可以用于图像细胞术、荧光显微镜和其他基于多色荧光的检测方法。这些 OMIP 的开发和发布不仅有助于减轻面板开发和优化的负担，因为它提供了用于优化每个面板的技术细节和实验条件（在已发表的研究报告中通常省略这些细节），而且还创建了一个 OMIP 在线存储库，以便所有研究人员可以轻松搜索和访问信息。此外，他们的出版物为同行评审优化面板数据提供了一个流程，并为研究人员提供了一个平台，使他们能够因开发 OMIP 所付出的努力和精力而获得认可和荣誉 [4]。
OMIP 的组成部分
根据定义，OMIP 出版物包括执行感兴趣的面板所需的所有必要信息。出版物包括实验目的概述、抗体克隆和荧光团组合列表、样本类型信息以及与现有OMIP的相似性；代表性图表显示了实验结果，包括门控方案。补充材料提供了开发策略、详细的染色方案以及抗体结合物滴定和实验板优化的技术信息。用于识别每个 OMIP 的命名法以“OMIP-001”[2] 开头，随着新的OMIP经过同行评审并在《细胞计量学 A 部分》上发表，数字编号将继续增加。迄今为止，已发表的大多数 OMIP 都是为流式细胞术开发的，这可能是由于使用该平台进行免疫表型研究的复杂性所致。
OMIP-009 是为流式细胞术开发的 OMIP 的一个例子，旨在研究人类 T 细胞对患者疫苗接种的免疫反应 [3]。用于研究的标记试剂列表以及赛默飞世尔科技公司的相应产品见表 1。使用该试剂盒优化条件获得的数据见图 1 [3]。
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图 1.使用 OMIP-009 进行免疫表型分析的示例。数据显示了 pp65 多肽池（15 个氨基酸，重叠 11 个）刺激 CMV1 供体细胞的结果。(A) 通过前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）图确定单细胞。排除不可存活的细胞和 CD3+ 细胞，只选择活体 CD3+ T 细胞。通过 FSC-A 与侧向散射面积（SSC-A）图，可以进一步去除散射极低的细胞。然后，将选定的 CD3+ T 细胞群进一步划分为 CD4+ 和 CD8+T 细胞。(B) 选择 CD4+ 或 CD8+ T 细胞，确定每种细胞因子的反应细胞百分比。(C) 在 FlowJo 分析程序中，使用布尔逻辑的“或”功能，从现有的细胞因子门控组合（即 IFN-γ+ 或 IL-2+ 或 TNF+）中创建一个单一的门控，用于捕获所有产生细胞因子的细胞。因此，任何产生一种或多种细胞因子的细胞都会被包含在该门控中。然后将总细胞因子反应（红色）叠加到相应的 CD4+（顶部）或 CD8+（底部）T 细胞谱系（灰色）上，以识别反应细胞的成熟和激活表型。经 John Wiley& Sons Inc 许可转载：Lamoreaux L、Koup RA、Roederer M（2012）OMIP-009：Characterization of antigen-specific human T-cells.Cytometry A 81:362–363。
表 1.OMIP-009：抗原特异性人类T 细胞的表征 [3] 以及赛默飞世尔科技的可比产品。
| OMIP-009[3] 使用的试剂 | 赛默飞世尔科技的可比产品 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 标志物 | 克隆 | 荧光基团 | 标志物 | 克隆 | 荧光基团 | 数量 | 货号 | |
| IFN-γ | B27 | APC | IFN-γ | B27 | APC | 500 µL | MHCIFG05 | |
| IL-2 | MQ1-17H12 | PE | IL-2 | MQ1-17H12 | PE | 500 µL | RHCIL204 | |
| TNF | Mab11 | FITC | TNF | Mab11 | FITC | 50 µg | A18469 | |
| CD3 | SP342 | APC-Cy 7 | CD3 | UCHT1 | APC-Cy 7 | 100 µg | A15440 | |
| CD4 | T4 | ECD (PE – Texas Red) | CD4 | S3.5 | PE–Texas Red | 0.5 mL | MHCD0417 | |
| CD8 | RPA-T8 | Pacific Blue | CD8 | 3B5 | Pacific Blue | 500 µL | MHCD0828 | |
| CD45RA | L48 | PE-Cy 7 | CD45RA | HI100 | PE-Cy 7 | 25 次检测 | A16358. | |
| CD28 | CD28.2 | PE-Cy 5 | CD28 | 不可用 | ||||
| CCR7 (CD197) | 150503 | Alexa Fluor 680 | CCR7 (CD197) | 不可用 | ||||
| 死细胞 | 不适用 | 活/死可修复水渍 | 死细胞 | 不适用 | 活/死可修复水渍 | 80 次检测 200 次检测 400 次 | L34965 L34957 L34966 | |
面板设计方法
OMIP 出版物使研究人员能够节省大量时间和金钱来创建自己的面板。即使 OMIP 并不完全适合某项特定研究，但回顾其他研究人员在开发类似 OMIP 时所采用的方法，对于设计新的面板可能非常宝贵。在为流式细胞术或其他基于多色荧光的检测方法开发新的面板时，其他考虑因素包括：
- 系统的生物学：有关细胞群、抗原密度和标记物共表达的信息将有助于制定门控策略。
- 仪器：仪器的光学配置，包括可用激发波长和发射滤光片，将决定检测策略。
- 抗体特性：在滴定每种抗体结合物以获得最佳染色指数后，选择特定的抗体克隆将有助于最大限度地提高不同细胞状态和细胞类型的分辨率。
- 荧光团特性：理想的试剂亮度取决于荧光团的消光系数和量子产额、仪器的激发源强度和荧光收集效率，以及溢出扩散矩阵、补偿要求和系统中的自发荧光。
有多种资源可以帮助您开始自己的面板优化工作 [5-11]，包括在《生物探针》第 71 期上发表的一篇题为《流式细胞仪面板设计：基础》的短文 [8]。
参考文献
- Mahnke Y, Chattopadhyay P, Roederer M (2010) Publication of optimized multicolor immunofluorescence panels.Cytometry A 77:814–818.
- Mahnke YD, Roederer M (2010) OMIP-001: Quality and phenotype of Ag-responsive human T-cells.Cytometry A 77:819-820.
- Lamoreaux L、Koup RA、Roederer M（2012）OMIP-009：Characterization of antigen-specific human T-cells.Cytometry A 81:362-363.
- Tárnok A (2016) OMIPs start school.Cytometry A 89:795–796..
- ExCyte Expert 流式细胞仪 课程选项
- Verity House Software annual flow cytometry course information
- BioProbes 71 Molecular Probes Journal of Cell Biology Applications.(June 2015) Flow cytometry panel design: The basics.
- 赛默飞世尔科技提供的流式细胞仪试剂盒设计工具
- 来自流式细胞仪的 OMIP 信息
- 许多 OMIP 的数据文件都是免费的，可在 http://flowrepository.org 上在线访问
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