DAPI 复染实验方案

蓝色荧光 DAPI 核酸染色剂会优先染色 dsDNA；它会与 DNA 双链小沟中的 AT 簇相互作用。¹DAPI 与 dsDNA 结合会生成 20 倍左右的荧光增强效应，看起来是由于 DAPI 和小沟中的水分子位移所致。²DAPI 也能与 RNA 结合，不过结合模式有所不同 — 一种猜测是与 AU 选择性的嵌入有关。³与 DAPI/dsDNA 复合物相比，DAPI/RNA 复合物的最大荧光发射波长较长（~500nm vs. ~460nm），量子产率只有 DAPI/dsDNA 复合物的 20%。⁴

DAPI 是常用的核复染染色剂，可用于开展多色荧光技术。它的蓝色荧光与其他结构中的绿色、黄色或红色荧光探针形成了鲜明对比。按照我们推荐的实验方案进行使用时，DAPI 可特异性地染色细胞核，很少或不会对胞浆进行标记。DAPI 和 DAPI 双乳酸盐（dilactate）均适用于本实验方案。DAPI 双乳酸盐配方的水溶性可能更好。本复染实验方案可与各类细胞学标记技术相兼容 - 基于抗体的直接检测法或间接检测法，mRNA 原位杂交，或使用细胞结构特异性的荧光试剂进行染色。DAPI 也能够在多色流式细胞术实验中用于荧光标记细胞的分析。下列实验方案可针对组织染色或非固定细胞/组织的染色应用进行调整。

荧光光谱属性

DAPI 与 dsRNA 结合的最大激发波长为 358 nm，最大发射波长为 461 nm。DAPI 可用氙灯或弧光灯，或紫外 (UV)  激光激发。DAPI 适用于以 UV 作为激发光源的流式细胞仪检测系统。

请从下列 DAPI 形式中选择一种：

• DAPI 二氢氯化物（MW=350.3）
• DAPI 二氢氯化物，FluoroPure 级（纯度为 98%）
• DAPI 二乳酸盐（MW=457.5）
  

不同应用可能需要  下列不同的材料：

用于荧光显微检测

• 磷酸缓冲生理盐水（PBS）
• 可选：抗淬灭试剂（除Invitrogen ProLong Gold 或 SlowFade Gold 试剂）
  

用于流式细胞分析 

• PBS
• 无水乙醇
• 染色缓冲液 （100 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM CaCl₂、0.5 mM MgCl₂、0.1% Nonidet P-40）。每一份细胞样本需要 1 mL 体积的染色液。
  

用于染色体的 FISH 染色

• PBS
• dH₂O
• 蜡或指甲油
• 可选：抗淬灭剂（除ProLong Gold 或 SlowFade Gold 试剂）
  

制备 DAPI 储液

如需配制 5 mg/mL DAPI 储液（14.3 mM 二氢氯化物或 10.9 mM 磷酸盐），将一小瓶（10 mg）药剂溶解于 2 mL 去离子水（dH₂O）或二甲基甲酰胺（DMF）中。水溶性较低的 DAPI 二氢氯化物可能需要花一些时间才能在水中完全溶解，也可能需要超声处理来促进溶解。

注：这些 DAPI 衍生物在 PBS 中的溶解度均较低。

储存与处理

长期储存时，可将储液分装，并将其储存在–20°C 温度下；短期储存时，可将溶液在 2–6°C 下避光保存。如果处理得当，DAPI 溶液可稳定储存至少六个月。

注意： DAPI 是已知的诱变剂，需谨慎处理。染料需按照本地可执行的规范要求进行安全处理。

样本制备

使用适合您样本的固定方案。DAPI 染色通常在所有其他染色操作完成后进行。请注意，使用 DAPI 进行复染并不一定需要样本的固定和通透处理。

复染实验方案

1. 将样品在磷酸缓冲液（PBS）中简单平衡。
   
2. 将 DAPI 储液在 PBS 中稀释至 300 nM。在盖玻片制备过程中加入约 300 µL 稀释后的 DAPI 染色液，确保细胞被染色液完全覆盖。
3. 孵育 1-5 分钟。
4. 在 PBS 中润洗样本数次。从盖玻片上排除多余的缓冲液后进行封片。 我们推荐用户使用含有抗淬灭试剂（如我们的 SlowFade Gold 抗淬灭试剂或 ProLong Gold 抗淬灭试剂）的封固剂。
5. 使用荧光显微镜和适当的滤镜浏览样本

样本制备

请使用适合您样本的固定实验方案，或使用如下实验方案：

1. 收集 2×10⁵ 至1 × 10⁶ 的细胞悬液。
2. 通过离心来沉淀细胞，并弃去上清液。
3. 轻轻敲打离心管，使细胞沉淀在残余液体中重悬，之后在室温条件下加入 1 mL PBS。
4. 将全部体积的重悬细胞移至–20°C 下的 4 mL 无水乙醇中，在以最高速度振荡的过程中，再将细胞悬液缓慢吹入乙醇。将细胞和乙醇在 –20°C 条件下孵育 5-15 分钟。
5. 通过离心来沉淀细胞，并弃去乙醇。
6. 轻轻敲打离心管，使细胞沉淀松脱，再于室温下加入 5 mL PBS。让细胞脱水 15 分钟。
   

复染实验方案 

1. 在染色缓冲液（100 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM CaCl₂、0.5 mM MgCl₂、0.1% Nonidet P-40）中将 DAPI 储液稀释至 3 µM。每一份细胞样本需要 1 mL 体积的染色液。
2. 离心细胞悬液（步骤 2.6），并弃去上清液。轻敲以松脱沉淀，再加入 1 mL 以染色缓冲液稀释的 DAPI 试剂。
3. 在室温下孵育 15 分钟。
4. 在染色剂存在的条件下使用流式细胞术进行分析。如需通过荧光显微镜观察细胞，则需离心样本，去除上清液，并在新鲜缓冲液中重悬细胞。在显微镜玻片上滴一滴悬液，封上盖玻片再进行观察。

样本制备

按照标准步骤 5.6 来制备样本。在复染前使用 dH2O 对最后的制备产物进行简单润洗，以去除玻片上残余的缓冲盐份。这一最终润洗步骤将有助于减少玻璃上的非特异性背景染色。风干制备产物。

复染实验方案

1. 将 DAPI 储液在 PBS 中稀释至 30 nM。用移液管吸取 300 µL染色液直接滴在标本上。可使用塑料盖玻片将染料均匀涂布在玻片上。
2. 在室温条件下避光孵育样本 30 分钟。
3. 小心移去盖玻片，并使用 PBS 或 dH₂O 简单润洗标本，以去除未结合的染料。
4. 使用吸收能力强的材料轻轻吸取样本周围多余的液体。
5. 在玻片上放置一个玻璃盖玻片，再使用蜡或指甲油对边角进行封闭。另外，也可以按照生产商的说明，用抗淬灭剂对该制备物进行封片。
6. 使用荧光显微镜和适当的滤镜浏览样本
   

1. Kubista M, Akerman B, Nordén B (1987) Biochemistry 26:4545–53.
   
2. Barcellona ML, Cardiel G, Gratton E (1990) Biochem Biophys Res Commun 170:270–80.
   
3. Tanious FA, Veal JM, Buczak H, et al.(1992) Biochemistry 31:3103–12.
   
4. Kapuscinski J (1990) J Histochem Cytochem 38:1323–29.
   
5. Uhl GR (1989) Methods Enzymol 168:741–52.
   
6. Pardue, ML (1985) In Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, BD Hames and SJ Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, England.