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介绍

测量细胞增殖是评估细胞健康、遗传毒性和药物功效的基础。传统上如下评估细胞增殖：将细胞与掺入 DNA 中并且通过放射性、抗体或点击化学检测的核苷类似物的单一“脉冲”。一些应用，如药物功效测试，受益自不同时间点掺入两种不同的类似物（双重脉冲标记），这可以进一步界定细胞周期动力学。随着可获得新的高特异性抗 BrdU 抗体，BrdU 标记技术可以与点击化学检测技术联合用于简化的双重脉冲标记方法。 

传统的细胞增殖检测法已经利用 DNA 合成期间掺入胸苷类似物 BrdU（5-溴-2´-脱氧尿苷），继而用抗 BrdU 抗体检测 [1-4]。这种方法正迅速为基于点击化学的Click-iT EdU 测定法所取代[5,6]，原因是不同于 BrdU 测定法，Click-iT EdU 测定法不基于抗体并且因此不需要 DNA 变性来检测掺入的核苷。Click-iT 测定法使用修饰的核苷，即 EdU（5-乙炔基-2´-脱氧尿苷），后者在 DNA 合成期间掺入并使用点击反应（一种在叠氮化物和炔之间的铜催化反应）检测。

材料

  • 完全 RPMI 培养基/10% FBS 中的 Jurkat 细胞
  • BrdU (5-溴脱氧尿苷)(B23151)(DMSO 中 10mM)
  • EdU (5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)(DMSO 中 10mM) 
  • PBS pH7.2 (GIBCO(R))
  • 70% 乙醇，冰冷
  • 4M HCl
  • 磷酸盐/柠檬酸缓冲液，pH 7.4  (182 ml 0.2M Na2HPO4+18ml 0.1M 柠檬酸)
  • 抗体稀释缓冲液 (PBS + 0.1% Triton X-100 + 1% BSA) —新鲜配制
  • 纯化的抗 BrdU 抗体 (克隆 MoBU-1) (B35141) 0.1 mg/ml；使用 2.5ul
  • 抗 BrdU-(克隆 Br3) 纯  MD5300 批号 0903 0.4mg/mL 滴度使用：2.5uL
  • 山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor® 488 二抗 2mg/mL，1:20 稀释并使用 2.5ul/测试 (0.25ug/测试) (A11001)
  • Tris 缓冲液盐水
    CuSO4 100mM
  • 100mM 抗坏血酸 (新鲜配制)
  • AF647- 叠氮化物 20uM DMSO  A10277
  • FxCycle™ Violet 1mg/ml DI F10347 使用 0.5µl/0.5ml

方案

  1. 将 Jurkat 细胞用于完全 RPMI-1640 培养基中并分入 5 个培养瓶
  2. 培养瓶 1：对照；培养瓶 2：10 uM BrdU 1 小时；培养瓶 3：20 uM EdU 1 小时；培养瓶 4：10µM BrdU + 20µM Edu EdU 在一起 1 小时；培养瓶 5：20µM EdU 1 小时，然后 10µM BrdU 1 小时。  孵育 37°C/5%
  3. 孵育后，将细胞离心、沉淀并移除上清液。 
  4. 细胞固定：向 15mL 含细胞沉淀物的试管添加 10 mL 冰冷的 70% 乙醇，首先逐滴添加同时涡旋混合，混合均匀。
  5. 储存在 -20°C  直至使用为止，4 小时至数月。
  6. 将细胞离心、沉淀并且 & 丢弃上清液；涡旋混合沉淀物
  7. 在室温于 2.0mL 4M Hcl 中重悬沉淀物 20 分钟。
  8. 添加 10ml 磷酸盐/柠檬酸缓冲液，离心并且滗析上清液。过滤掉大团块
  9. 在 PBS/0.1%TritonTM/1%BSA (抗体染色溶液) 中重悬洗涤 & 沉淀物。
  10. 反复洗涤。
  11. 重悬于 PBS/0.1%Triton/1%BSA (抗体染色溶液) 中，调整浓度至 1x107/ml。
  12. 添加 100µl μl 细胞悬液至指定的试管。
  13. 配制点击反应，并且添加 0.5ml 至指定的试管
  14. 在室温避光孵育 30 分钟 
  15. 洗涤 x1 PBS/0.1%Triton/1%BSA
  16. 添加纯化的抗 BrdU 抗体至指定的试管
  17. 在室温避光孵育 20 分钟
  18. 用 3 ml PBS/0.1%Triton/1%BSA (抗体染色溶液) 洗涤，将沉淀物离心 &。
  19. 添加山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488 二抗，在室温孵育 30 分钟，然后如步骤 15 中那样洗涤。
  20. 将沉淀物重悬于 0.5ml PBS/0.1%Triton/1% BSA (抗体染色液) 中
  21. 添加 0.5µL FxCycle Violet 染液
  22. 在室温避光孵育 15-30 分钟
  23. 在 LSRII 上运行
  24. 使用蓝色激光激发和 525/50 发射滤光片分析 Alexa Fluor 488，使用红色激光激发和 660/20 发射滤光片分析 Alexa Fluor 647，以及使用紫色激光激发和 450/50 发射滤光片分析FxCycleViolet， 
  25. 对主要细胞群设门，并对于单色数据，收集 10,000 个设门事件。对于三色样品，对 WVA 设置单个门，收集 20,000 个单一事件。
参考文献
  1. Gratzner HG (1982) Science 218:474–475.
  2. Dolbeare F, Selden JR (1994) Methods Cell Biol 41:297–316.
  3. Li X, Darzynkiewicz Z (1995) Cell Prolif 28:571–579.
  4. Conboy MJ, Karasov AO, Rando TA (2007) PLoS Biology 5:1120–1126.
  5. Salic A, Mitchison TJ (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105:2415–2420.
  6. Buck SB, Bradford J, Gee KR et al.(2008) Biotechniques 44:927–929.
  7. Current Protocols in Cytometry Vol. 1, JP Robinson, Ed., John Wiley & Sons Inc. (2007)
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