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相关产品信息

介绍

预期用途

Dynabeads 链霉亲和素适合多种应用，包括蛋白质纯化、核酸纯化、蛋白质相互作用研究、免疫沉淀、免疫检测、噬菌体展示、生物淘洗、药物筛选和细胞分离。

使用指南

所有 Dynabeads 链霉亲和素均可与生物素化分子配合使用。由于其特性，一些磁珠更适用于特定应用。Dynabeads M-280 链霉亲和素和 Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 通常用于蛋白和核酸应用。Dynabeads M-270 链霉亲和素和 Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1 是核酸诊断的首选，尤其是高离液盐浓度样品，涉及生物素化小抗原的免疫分析以及与 BSA 不兼容的应用（磁珠不用 BSA 封闭）。MyOne Dynabeads 提供更高的结合能力和更慢的沉降速度，因此在自动化应用和/或分离大量生物素标记的配体或特定的靶标中脱颖而出。

材料描述

Dynabeads 链霉亲和素是均一的超顺磁性微球，表面通过共价键结合有一单层亲和素分子。这一亲和素单分子层有助于确保链霉亲和素的渗漏可以忽略不计，同时没有过量吸附的链霉亲和素有助于确保批次间结果的一致性。这些磁珠可轻松而稳定地结合生物素化分子，如小分子，肽，蛋白，抗体，糖， 凝集素，寡核苷酸， DNA/RNA 等。

提供的材料

表 1. Dynabeads 链霉亲和素试剂盒（小包装）中提供的材料。叠氮化钠（NaN 3）用作防腐剂。缩略词：体积（V）磷酸盐缓冲液（PBS）

Dynabeads 磁珠V [mL]浓度 [mg/mL]提供形式磁珠直径 [μm]
M-280 链霉亲和素磁珠110 6-7x108 磁珠/mL）PBS ， pH 7.4 /0.1% BSA/0.02% NaN32.8
M-270 链霉亲和素磁珠110（6-7x108 磁珠/mL）PBS ， pH 7.4/0.09% NaN32.8
MyOne 链霉亲和素 C1110（7-12x109 磁珠/mL）PBS ， pH 7.4/0.01% 吐温® -20/0.09% NaN31.0
MyOne 链霉亲和素 T1110（7-12 x 109 磁珠/mL）PBS ， pH 7.4 /0.1% BSA/0.02% NaN31.0

试验要求的其他材料

  • 手动或自动实验方案所需的磁力架（Dynal MPC）。请参阅 建议。
  • 带倾斜和旋转功能的混匀器。
  • 缓冲液和溶液（见 表2）。
  • 生物素标记的化合物。有关生物素标记的建议，请参见 dynal。《手册》第 4.2 部分（http://probes.invitrogen.com/handbook）中有关于可选择的生物素标记试剂的指南。

表2. 推荐的缓冲液和溶液：

用于结合核酸用于在 RNA 操作前处理 Dynabeads用于结合蛋白和其它分子
结合和洗涤（B&&W）缓冲液（2x）：

10 mM Tris-HCl（pH 7.5）

1 mM EDTA

2 M NaCl		溶液A：DEPC 处理的 0.1 M NaOH，
DEPC 处理的 0.05 M NaCl

溶液B：DEPC 处理的 0.1 M NaCl		pH 7.4 的 PBS 缓冲液如有必要也可使用下列缓冲液：

 PBS/BSA（PBS ， pH 7.4 ，含 0.1%（w/v）BSA）PBST（PBS ， pH 7.4 ，含 0.01%（v/v）Tween® 20）

所选结合/洗涤缓冲液的盐浓度和 pH（通常为 5-9）可根据
要固定的分子类型而定。带有固定分子的磁珠在常用缓冲液中是稳定的。

DEPC 处理：

添加 DEPC 至溶液 A 或 B 中至最终浓度为 0.1%（1mL/L）。 用力摇晃，在室温下孵育 1 小时。高压灭菌后即用。

PBS 缓冲液 pH 7.4 的配方：

0.26 g NaH 2PO 4 x H 2O（分子量 137.99）
1.44 g Na 2HPO 4 x H 2O（分子量 177.99）
8.78 g NaCl（分子量 58.5）

溶解在 900 毫升蒸馏水中，必要时调节 pH 值，然后调节至 1 升。

原理

将 Dynabeads 添加至含有生物素标记分子的样品中。经过短时孵育，生物素标记分子将结合到磁珠上。用磁力架分离分子-磁珠复合体。可以对捕获、洗涤和检测过程进行优化以适于手动或自动应用。进行间接捕获时，先将生物素标记分子与样品混合以捕获分子-靶标复合体，然后加入 Dynabeads。当分子-目标动力学缓慢、亲和力弱、分子浓度低或分子-目标结合需要最佳的分子定向和真正的液相动力学时，间接目标捕获就会发挥优势。

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实验方案

重要提示

  • 在实验方案中，我们建议将试管放在磁力架上最多 2 分钟，以确保所有磁珠都收集在管壁上。对于非黏性样品，一旦您能看到所收集的磁珠，通常可在 1 分钟内完成分离。
  • 如果您不需要去除防腐剂或更换缓冲液，可省略清洗步骤。
  • 对于稀释的样本或大体积样本，可提高孵育时间或使用相同的磁珠分批多次提取。
  • 使用混匀器倾斜/旋转试管，以免 Dynabeads 沉淀在管底。
  • 移液时，避免出现气泡。
  • 样本内游离的生物素或生物素标记的引物会降低磁珠的结合能力。一次性分离柱或离心柱可以除去未结合的生物素。使用低浓度的生物素标记引物进行 PCR，或者用超滤、微透析或其它纯化步骤除去游离的生物素标记引物。


固定流程

磁珠制备

  1. 通过旋转或涡旋将磁珠重悬在原始小瓶中。
  2. 根据结合能力（见表3）计算所需要的磁珠量，并将磁珠转移至一个新的试管。
  3. 清洗 Dynabeads 以去除防腐剂。
    • 核酸应用：1X B&W 缓冲液
    • 抗体/蛋白应用：PBS，pH 7.4

    4. 推荐的洗涤缓冲液:

    备注：  

    洗涤流程

  4. 将含磁珠的试管放在磁力架上 1-2 分钟。
  5. 当试管在磁力架上时，用移液管抽吸移除上清液。
  6. 从磁力架中取出试管。
  7. 沿收集磁珠的试管内部加入洗涤缓冲液，然后重悬
    （洗涤缓冲液的体积与从小瓶中取出的 Dynabeads 的初始体积相同或更大）。
  8. 重复步骤4至7两次，共洗涤3次。

    如果使用 Dynabeads 进行 RNA 操作：

    因为 Dynabeads 链霉亲和素 不 是在无 RNA 酶的溶液中提供，所以在洗涤之后需要进行以下步骤以进行 RNA 应用：

  9. 在溶液 A 中洗涤磁珠两次，持续 2 分钟。使用与步骤 7 中推荐的相同体积的磁珠。
  10. 使用溶液 B 洗涤磁珠一次。使用和第 9 步中相同体积的磁珠。
  11. 使用溶液 B 重悬磁珠。

    磁珠现在即可用于包被您所选择的生物素化分子了。

    一般固定方案

    使用前洗涤 Dynabeads。
                                                                                                                                                                                                              返回顶部
    1. 向洗涤后的 Dynabeads 中加入生物素标记的分子。
    2. 室温孵育 15-30 分钟，同时轻轻旋转试管。
    3. 将试管放于磁力架上 2-3 分钟，弃上清。
    4. 使用洗涤缓冲液洗涤包被磁珠 3-4 次。
    5. 以适当浓度重悬于适合下游应用的适当缓冲液中。

    下面是针对特定应用的结合实验方案实例。

    核酸结合

    1. 将磁珠重悬于 2x B&&W缓冲液中至终浓度 5 μg/μL（两倍于初始体积）。
    2. 加入溶于 H2O 中的生物素标记的 DNA/RNA，使 2x B&&W 缓冲液中的 NaCl 浓度从 2M 稀释为 1M 以实现最优结合效果。
    3. 室温孵育 15 分钟，同时轻轻旋转试管。孵育时间取决于核酸长度：短寡核苷酸（< 30 个碱基）需要最长 10 分钟。长达 1 kb 的 DNA 片段需要 15 分钟。
    4. 放入磁力架 2-3 分钟，分离被生物素标记的 DNA/RNA 包被的磁珠。
    5. 使用 1x B&&W 缓冲液洗涤 2-3 遍。
    6. 重悬至所需的浓度。结合现在已完成。于低盐浓度并适合下游应用的缓冲液中重悬结合 DNA/RNA 片段的磁珠。

    抗体/蛋白结合

    1. 将磁珠和生物素标记的抗体在 PBS 中室温孵育 30 分钟，同时轻轻旋转试管。
    2. 放入磁力架 2-3 分钟以分离被抗体包被的磁珠。
    3. 使用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤微珠 4-5 次。
    4. 重悬至您的应用所需的浓度。


    释放被结合的生物素标记分子

    严苛条件可以使生物素-亲和素的结合断裂。用含 10 mM EDTA，pH 8.2 的 95% 甲酰胺在 65°C 下孵育 5 分钟或在 90°C 孵育下 2 分钟，通常可以解离超过 >96% 结合的生物素标记 DNA。或者，将样品在 0.1% SDS 中放置  5 分钟以进行解离。请注意，经过此处理  蛋白将被变性并且 Dynabeads® 亲和素将不能再使用。还有报道说，可在超过 70°C 的去离子水溶液中短暂孵育，解离生物素-亲和素之间的相互作用。

    免疫检测策略

    Dynabeads 磁珠由于其高表面积/重量比、均一性、出色的批次间重现性，且可根据自动化工艺轻松灵活调整，从而成为免疫检测开发的首选固相。

    自动化

    使用 Dynabeads 进行的磁珠分离和操作可以在多种液体操作平台上实现自动化。Dynabeads MyOne 因体积小、沉降率低和磁迁移率高而非常适合自动化应用。

    技术信息

    结合能力

    结合分子的大小和生物素标记过程都会影响结合能力。生物素标记的大分子和小分子都可以被结合。对于生物素标记分子的结合能力取决于可用的空间和磁珠与分子之间及分子与分子之间的电荷相互作用。在结合之后，磁珠表面的每个亲和素分子有两个或三个生物素结合位点。

    • 优化用于特定应用的磁珠量。
    • 使用超过结合能力两倍的生物素分子以饱和结合亲和素。
    • 结合效率可以通过对比结合前和结合后的分子浓度得出。

    表 3：1mg Dynabeads 的典型结合能力


    Dynabeads 磁珠M-280 链霉亲和素磁珠M-270 链霉亲和素磁珠MyOne 链霉亲和素 C1MyOne 链霉亲和素 T1
    游离生物素 [pmol]650 – 900≥ 950≥ 25001100-1700
    生物素标记的肽段 [pmol]~ 200~ 200~ 400~ 400
    生物素标记的抗体 [μg]最多 10最多 10最多 20最多 20
    双链 DNA [μg] *）~ 10~ 10~ 20~ 20
    双链 DNA [μg] *）~ 200~ 200~ 500~ 400

    *寡核苷酸和 DNA 片段对于寡核苷酸而言，结合能力和分子量（碱基数）成反比。大分子量 DNA 片段的结合能力下降可能是由于空间位阻。

参考文献

  1. Holmberg et al.(2005) The biotin-Streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures.Electrophoresis 26, 501-510.
658.01D.indd      5-5-2007

仅供科研使用，不可用于诊断目的。

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