Search Thermo Fisher Scientific
蛋白质印迹法总蛋白标准化试剂
总蛋白标准化
总蛋白标准化是获得精确、定量蛋白质印迹法数据的有用方法。Invitrogen 免染型蛋白标记试剂是一种快速、易用、共价蛋白标记试剂，用于蛋白质转移后的凝胶或膜，可对蛋白质进行灵敏的线性检测，从而实现蛋白质印迹法数据的总蛋白标准化。Invitrogen 免染型试剂还可作为快速、灵敏的蛋白标记试剂，用于凝胶中蛋白的可视化。
免染型蛋白标记试剂
- 用途广泛—用于在凝胶和膜上快速标记总蛋白。与所有凝胶化学试剂兼容，可用于下游凝胶染色、蛋白转移、免疫印迹和质谱分析。兼容。
- 新 更快的操作流程—混合、孵育和成像。凝胶和转移膜的反应时间均为 10 分钟。
- 灵活的可视化使用各种广泛的激发源，包括紫外光和绿色荧光。最佳成像条件：最大曝光时间：~488 nm., 最大曝光时间：590 nm.
- 精确的总蛋白标准化—使用 iBright FL1500 成像系统，成像和总蛋白标准化分析仅需几分钟
- 宽线性动态范围—每孔可加样总蛋白为 1–80 µg。
- 灵敏且稳定的信号—可检测低至 20 ng 的蛋白条带，且信号与下游抗体检测兼容。
- 灵敏度可调—延长孵育时间或加倍试剂浓度可产生更强信号，从而提高对低丰度蛋白的检测能力。
操作视频
如何使用 Invitrogen No-Stain 免染型蛋白标记试剂和 iBright 成像系统快速、简单、准确地进行总蛋白归一化
本视频详细介绍了如何使用免染型蛋白质标记试剂标记被染色的蛋白质。视频的后半部分介绍了使用 iBright 成像系统对蛋白质印迹法数据进行总蛋白标准化所需的仪器操作步骤。
演示视频
如何使用Invitrogen No-Stain蛋白标记试剂和iBright智能成像系统进行快速、简单和准确的定量Western Blot
这个演示视频为您展现如何使用No-Stain蛋白标记试剂快速、简单地标记印迹上的蛋白质。视频的后半部分逐步演示了如何在iBright智能成像系统上对western blot数据进行总蛋白归一化。
| 订购 | 标标准套装包括 40 个小型凝胶膜或 40 个小型凝胶，或两者的组合。 |
| 反应时间 | 10 分钟 |
| 凝胶兼容性 | 与任何凝胶类型（预制或自行配置）或凝胶化学（(Bis-Tris, Tris-glycine, Tris-acetate, Tricine）兼容 |
| 膜兼容性 | PVDF、硝酸纤维素PVDF、硝酸纤维素膜 |
| 免疫检测试剂兼容性 | 与所有下游免疫检测步骤兼容，包括化学发光或荧光检测 |
| 激发和发射最大值 | 激发波长：~488 nm（蓝光） 发射波长：590 nm |
| 检测灵敏度 | 20 ng/条带 |
| 线性范围 | 每条泳道总蛋白加样量为 1–80 μg |
| 成像仪要求 | 兼容各种带有紫外或荧光光源的成像仪，例如 iBright FL1500 成像系统 |
| 工作原理是什么？ | 免染型蛋白标记试剂与所有蛋白样品中的部分赖氨酸氨基酸侧链形成共价键 |
| 试剂盒成分和储存条件 | 免染型活化剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型衍生剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型标记缓冲液，20 倍（每瓶 2 x 20 mL；储存温度为15—30⁰C） |
| 保质期 | 至少 2 年 |
用于在凝胶或转印膜上标记蛋白质的免染型方案
图 1：No-Stain 免染型蛋白标记试剂的使用方法
免染型蛋白标记试剂的制备
按照下表所示，混合所需试剂，制备适当体积的免染型蛋白标记试剂。
| 免染型蛋白标记试剂，1X | 免染型标记缓冲液，20X | 超纯水 | 免染型活化剂 | 免染型衍生剂 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 小型凝胶 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 20 µL | 20 µL |
| 小型膜 | 10 mL | 0.5 mL | 9.5 mL | 20 µL | 20 µL |
| 中型膜 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 40 µL | 40 µL |
在蛋白质印迹法中，不均匀的蛋白质样品浓度、凝胶上样品加样不一致以及电印迹过程中的转移变化都会导致结果的变化。蛋白质标准化用于校正这种变化，是获得可靠且可重复的定量蛋白质印迹数据的关键步骤。蛋白质标准化方法包括使用内源性管家蛋白对照（如 GAPDH、β-微管蛋白、β-肌动蛋白或亲环蛋白 B）、外源性加样对照或总蛋白标准化。
近年来，期刊编辑和审稿人要求采用能够提高定量蛋白质印迹法数据准确性和可重复性的方法。许多知名期刊已经制定了蛋白质印迹法研究投稿指南，以下摘录了部分指南内容。
- “进行定量比较时，应使用适当的试剂、对照和线性信号范围的成像方法” – 《自然》
- “记录数据的获取方式、信号强度是否与抗原加样量呈线性关系以及蛋白加样如何标准化” – 《生物化学杂志》
- “尽可能将信号强度标准化为总蛋白加样量（通过染色膜评估总蛋白加样量）” – 《生物化学杂志》
- “在没有证据表明操作不影响表达的情况下，不应使用管家蛋白进行标准化” – 《生物化学杂志》
管家蛋白 的使用有其缺点，因为管家基因蛋白的表达会因实验条件而异，而且它们通常会产生过饱和的蛋白质印迹法信号。
使用免染型蛋白标记试剂进行总蛋白标准化，可避免使用管家蛋白 带来的变数和不准确性，并节省使用免疫印迹检测管家基因蛋白所需的时间、精力和成本，因为免疫印迹可能需要剥离印迹并重新检测。
在所有实验条件下，精确的加样对照应显示信号强度与样品加样量之间的线性关系。用免染型试剂标记膜上的总蛋白，可得到信号强度，在所有实验条件下，信号强度与样品加样量之间都呈线性关系（图 2）。因此，免染型试剂可用于定量蛋白质印迹法，将总蛋白作为理想的加样对照。
免染型试剂与管家蛋白的线性比较
下图 2 中的图表显示了使用免染型蛋白标记试剂进行总蛋白标准化时，线性信号响应与每孔加样蛋白量之间的关系。在更高的裂解液加样量下，管家蛋白的信号似乎趋于饱和，导致结果标准化不够精确。
图 2.使用免染型蛋白标记试剂进行总蛋白的标准化：将 10 至 50 µg 的 HeLa 裂解液加样到 4-12% 的 Bis-Tris Plus 凝胶中，并使用 MES 缓冲液进行电泳。使用 Invitrogen iBlot 2 凝胶转移装置和 iBlot 2 转移装置、PVDF、mini（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转移到 PVDF 膜上。在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗 PVDF 膜两次，每次 2 分钟，然后用 10 ml 免染型标记液在旋转平台上标记 10 分钟。然后在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗膜 3 次，每次 2 分钟，接着进行 β-肌动蛋白（货号：AM4302）、GAPDH（货号：398600）和 α-微管蛋白（货号：138000），然后用山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号：A21058）进行免疫印迹。使用 iBright 成像仪对印迹进行成像。通过 iBright 软件来定量泳道中的总蛋白信号。使用免染型蛋白标记试剂在整个加样范围内绘制数据的线性回归值被确定（R2= 0.9990），而 β-肌动蛋白、GAPDH 和 α-微管的R2值分别为 0.8851、0.9438和0.8332。
下图 3 展示了使用免染型蛋白标记试剂和硝酸纤维素膜对目标蛋白进行标准化。
图 3.使用免染型蛋白标记试剂和iBright成像系统进行定量蛋白质印迹分析。使用 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright 成像系统进行定量 WB 分析。使用 Novex 4-12% Tris-Glycine 凝胶（楔形孔格式）加样，并使用表达 RB1 的 HeLa 细胞裂解液进行电泳，总蛋白负荷为 0.6 至 10 µg。使用 iBlot 2 干式转印系统将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上使用免染型蛋白标记试剂对硝酸纤维素膜进行标记 10 分钟，然后用iBright成像仪对标记的膜进行成像。用同样经过免染型标记的膜，用一种用 Alexa Fluor 645 染料标记的特异性抗体检测 RB1。用 iBright 标准化软件对加样 HeLa 裂解液（0.6 至 10 µg）的泳道中的总蛋白信号以及 RB1免疫检测条带的信号强度进行定量。绘制总蛋白加样和 RB1 的信号强度曲线。
用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质
No-Stain 蛋白标记试剂在 10 分钟内与凝胶中的所有蛋白的赖氨酸侧链部分形成共价键。
- 它是传统凝胶染色试剂的绝佳替代品—无需脱色，可在各种蛋白质裂解液加样量（1-80µg）下实现精确标准化
- 灵敏——检测下限为20纳克/条带
- 特异——仅与蛋白质的赖氨酸侧链结合。游离标签不具有荧光性，因此可获得卓越的信噪比
- 灵活性——与任何凝胶类型兼容；无需更换凝胶即可获得免染型的便利性
下图4显示使用免染型蛋白标记试剂对印迹上的蛋白质进行标记，转移后呈线性且与加样蛋白质的量成比例。
图 4.膜上蛋白质的免染型标记信号响应呈线性。在 1 号泳道中，用 HeLa 裂解液（ 1 至 5050 µg）和 PageRuler 免染型蛋白质分子量标准加载 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型凝胶。使用 MES 运行缓冲液进行电泳后，使用 Invitrogen PowerBlotter 和 PowerBlotter Select Stacks 将蛋白质转移到 PVDF 膜上（10 分钟）。在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗 PVDF 膜两次，每次 2 分钟。向装有 PVDF 膜的皿中加入 10 ml 免染型标记溶液，启动免染型标记反应。在旋转平台上进行 10 分钟标记反应。然后在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗膜 3 次，每次 2 分钟。使用 iBright 成像仪，在免染型膜上设置曝光参数（455—485 nm 激发，565—615 nm 发射），然后拍摄图像。
定量凝胶染色
图 5 显示了使用免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质时，信号与蛋白质量的线性关系。
图 5.定量凝胶染色。将浓度为 2.5 至 80 µg 的HeLa 裂解液装入 4-12% 的 Bis-Tris Plus 小型凝胶，并用 MES 电泳缓冲液进行电泳。电泳后，按照凝胶中蛋白质标记的免染型蛋白质标记试剂盒的说明对凝胶中的蛋白质进行标记，并使用 iBright 成像仪对凝胶成像，该成像仪配有透射激发器（490-520 nm）和565-615 nm 发射滤光片。
免染型蛋白的信号强度随孵育时间增加
免染型蛋白标记试剂的灵敏度可以微调，以改善对低丰度蛋白的检测。使用免染型试剂延长凝胶或印迹的孵育时间，信号强度呈线性增加。或者，当时间有限时，将免染型蛋白标记试剂的浓度加倍，可在较短的标记时间内获得类似的结果。曝光时间可以轻松设置和调整，以适应实验条件，使用iBright成像系统，将方法检测能力扩展到更广泛的蛋白质表达水平。
点击图片放大
图 6：延长孵育时间可提高免染型标签试剂的灵敏度。转移的 PVDF（聚偏二氟乙烯）膜分别与免染型标签试剂孵育 10、20、30 和 40 分钟，随着时间的推移，信号强度增加。Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶上加载了 40至1.25 μg 的大肠杆菌裂解液，并使用 MES SDS 运行缓冲液进行电泳分离。使用 Invitrogen iBlot 2 凝胶转移装置和 iBlot 2 转移装置（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转移到小型 PVDF 膜上。用20 ml 超纯水快速冲洗 PVDF 膜，然后在旋转平台上用 10 ml 免染型蛋白标记试剂工作液进行孵育。在加入免染型蛋白标记试剂后 10、20、30 和 40 分钟，使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统采集印迹分析图像（曝光时间 1000 秒），未对图像进行亮度和对比度调整。曝光时间越长，信号越强，从而提高对低表达蛋白的检测能力（A）。可以观察到标准化信号强度与孵育时间呈线性相关（B）。
将免染型蛋白标记试剂的浓度加倍，信号强度会增强
点击图片放大
图7.将免染型标记试剂的浓度加倍可提高检测灵敏度。将 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶与 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 连续稀释液）一起加入 Bolt LDS 样品缓冲液中，然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质直接在凝胶上用 1 倍或 2 倍免染型试剂进行标记。1 倍免染型试剂根据免染型蛋白质标记试剂的标准方案制备。2 倍免染型蛋白质标记试剂通过将免染型活化剂（40μL）和免染型衍生剂（40μL）的浓度加倍制备。使用Invitrogen iBright FL1500成像系统（曝光时间1000秒）采集凝胶（A）和膜（B）的分析图像，未进行亮度和对比度调整。
免染型凝胶的免疫印迹
免染型蛋白标记试剂的多功能性延伸至蛋白质转移和免疫印迹。使用免染型试剂对蛋白质进行标记不会影响蛋白质转移效率，并且与下游蛋白质印迹法兼容，如图 8 所示。
点击图片以放大
图8.免染型标记试剂与蛋白质转移和免疫印迹兼容。将 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶与 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 连续稀释液）一起加入 Bolt LDS 样品缓冲液中，然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。将凝胶在旋转平台上与免染型蛋白标记试剂一起孵育 10 分钟。使用Invitrogen iBlot 2 凝胶转移装置和iBlot 2转移装置（P0 方案，7 分钟）将免染型标记的凝胶转移到 PVDF 膜上。然后使用特异性的一抗对 PVDF 膜进行检测，并使用标记有 Alexa 荧光 800 染料的二抗检测蛋白质。使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的分析图像。
灵敏度堪比考马斯染色，但所需时间更短
免染型蛋白标记试剂提供了一种快速、灵敏的方法，用于在凝胶和膜上可视化蛋白，无需冗长的脱色步骤和甲醇暴露。
点击图片放大
图9.免染型标记试剂的灵敏度与考马斯染色相当。将 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶与 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 连续稀释液）一起加入 Bolt LDS 样品缓冲液中，然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质条带用免染型蛋白标记试剂或考马斯亮蓝染料标记。使用Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的分析图像。此外，免染型图像的曝光时间可以增加，以便与考马斯蓝相比，更好地检测更低水平的裂解液。
免染型蛋白标记试剂与化学发光和荧光检测兼容。因此，您可以继续使用实验室已有的化学发光酶标二抗。在使用荧光抗体结合物设计实验时，重要的是选择与免染型标签的激发和发射光谱不重叠的荧光团，当免染型标签与赖氨酸残基共价结合时，在约 488 nm 光源激发下，在约 590 nm 处发光。荧光团的选择取决于荧光成像仪的滤光片组。
您可以将二级抗体荧光偶联物的激发和发射光谱与免染型标签的激发和发射光谱进行比较，以评估与当前抗体偶联物的兼容性。图 6 显示了共价结合的免染型标签的激发和发射光谱。
表 1.当使用免染型蛋白标记试剂与 iBright FL1500 成像系统时，兼容的荧光二抗。
点击放大图片
图 10.共价键连接的免染型标签的激发和发射光谱。共价键连接的免染型标签的激发最大值约为 488 nm，发射最大值为 590 nm。光谱显示，无污标签的信号可以使用紫外或荧光光源成像，并且可以使用各种发射滤光片捕获信号。
表1列出了在使用 iBright FL1500 成像系统成像时与共价连接的免染型标签兼容的荧光团的部分列表。任何共轭物都可以单独与无污标签和 iBright 成像仪一起使用。如果使用两种荧光团和无污蛋白质标记试剂进行多重标记，则从 600 nm 范围内选择一种荧光团，从 700 nm 范围内选择另一种荧光团，以便每种荧光团都可以通过不同的 iBright 发射滤光片成像。
表 1.与 iBright FL1500 成像系统一起使用免染型蛋白标记试剂时兼容的荧光二抗。
| 订购 | 标标准套装包括 40 个小型凝胶膜或 40 个小型凝胶，或两者的组合。 |
| 反应时间 | 10 分钟 |
| 凝胶兼容性 | 与任何凝胶类型（预制或自行配置）或凝胶化学（(Bis-Tris, Tris-glycine, Tris-acetate, Tricine）兼容 |
| 膜兼容性 | PVDF、硝酸纤维素PVDF、硝酸纤维素膜 |
| 免疫检测试剂兼容性 | 与所有下游免疫检测步骤兼容，包括化学发光或荧光检测 |
| 激发和发射最大值 | 激发波长：~488 nm（蓝光） 发射波长：590 nm |
| 检测灵敏度 | 20 ng/条带 |
| 线性范围 | 每条泳道总蛋白加样量为 1–80 μg |
| 成像仪要求 | 兼容各种带有紫外或荧光光源的成像仪，例如 iBright FL1500 成像系统 |
| 工作原理是什么？ | 免染型蛋白标记试剂与所有蛋白样品中的部分赖氨酸氨基酸侧链形成共价键 |
| 试剂盒成分和储存条件 | 免染型活化剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型衍生剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型标记缓冲液，20 倍（每瓶 2 x 20 mL；储存温度为15—30⁰C） |
| 保质期 | 至少 2 年 |
用于在凝胶或转印膜上标记蛋白质的免染型方案
图 1：No-Stain 免染型蛋白标记试剂的使用方法
免染型蛋白标记试剂的制备
按照下表所示，混合所需试剂，制备适当体积的免染型蛋白标记试剂。
| 免染型蛋白标记试剂，1X | 免染型标记缓冲液，20X | 超纯水 | 免染型活化剂 | 免染型衍生剂 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 小型凝胶 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 20 µL | 20 µL |
| 小型膜 | 10 mL | 0.5 mL | 9.5 mL | 20 µL | 20 µL |
| 中型膜 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 40 µL | 40 µL |
在蛋白质印迹法中，不均匀的蛋白质样品浓度、凝胶上样品加样不一致以及电印迹过程中的转移变化都会导致结果的变化。蛋白质标准化用于校正这种变化，是获得可靠且可重复的定量蛋白质印迹数据的关键步骤。蛋白质标准化方法包括使用内源性管家蛋白对照（如 GAPDH、β-微管蛋白、β-肌动蛋白或亲环蛋白 B）、外源性加样对照或总蛋白标准化。
近年来，期刊编辑和审稿人要求采用能够提高定量蛋白质印迹法数据准确性和可重复性的方法。许多知名期刊已经制定了蛋白质印迹法研究投稿指南，以下摘录了部分指南内容。
- “进行定量比较时，应使用适当的试剂、对照和线性信号范围的成像方法” – 《自然》
- “记录数据的获取方式、信号强度是否与抗原加样量呈线性关系以及蛋白加样如何标准化” – 《生物化学杂志》
- “尽可能将信号强度标准化为总蛋白加样量（通过染色膜评估总蛋白加样量）” – 《生物化学杂志》
- “在没有证据表明操作不影响表达的情况下，不应使用管家蛋白进行标准化” – 《生物化学杂志》
管家蛋白 的使用有其缺点，因为管家基因蛋白的表达会因实验条件而异，而且它们通常会产生过饱和的蛋白质印迹法信号。
使用免染型蛋白标记试剂进行总蛋白标准化，可避免使用管家蛋白 带来的变数和不准确性，并节省使用免疫印迹检测管家基因蛋白所需的时间、精力和成本，因为免疫印迹可能需要剥离印迹并重新检测。
在所有实验条件下，精确的加样对照应显示信号强度与样品加样量之间的线性关系。用免染型试剂标记膜上的总蛋白，可得到信号强度，在所有实验条件下，信号强度与样品加样量之间都呈线性关系（图 2）。因此，免染型试剂可用于定量蛋白质印迹法，将总蛋白作为理想的加样对照。
免染型试剂与管家蛋白的线性比较
下图 2 中的图表显示了使用免染型蛋白标记试剂进行总蛋白标准化时，线性信号响应与每孔加样蛋白量之间的关系。在更高的裂解液加样量下，管家蛋白的信号似乎趋于饱和，导致结果标准化不够精确。
图 2.使用免染型蛋白标记试剂进行总蛋白的标准化：将 10 至 50 µg 的 HeLa 裂解液加样到 4-12% 的 Bis-Tris Plus 凝胶中，并使用 MES 缓冲液进行电泳。使用 Invitrogen iBlot 2 凝胶转移装置和 iBlot 2 转移装置、PVDF、mini（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转移到 PVDF 膜上。在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗 PVDF 膜两次，每次 2 分钟，然后用 10 ml 免染型标记液在旋转平台上标记 10 分钟。然后在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗膜 3 次，每次 2 分钟，接着进行 β-肌动蛋白（货号：AM4302）、GAPDH（货号：398600）和 α-微管蛋白（货号：138000），然后用山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号：A21058）进行免疫印迹。使用 iBright 成像仪对印迹进行成像。通过 iBright 软件来定量泳道中的总蛋白信号。使用免染型蛋白标记试剂在整个加样范围内绘制数据的线性回归值被确定（R2= 0.9990），而 β-肌动蛋白、GAPDH 和 α-微管的R2值分别为 0.8851、0.9438和0.8332。
下图 3 展示了使用免染型蛋白标记试剂和硝酸纤维素膜对目标蛋白进行标准化。
图 3.使用免染型蛋白标记试剂和iBright成像系统进行定量蛋白质印迹分析。使用 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright 成像系统进行定量 WB 分析。使用 Novex 4-12% Tris-Glycine 凝胶（楔形孔格式）加样，并使用表达 RB1 的 HeLa 细胞裂解液进行电泳，总蛋白负荷为 0.6 至 10 µg。使用 iBlot 2 干式转印系统将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上使用免染型蛋白标记试剂对硝酸纤维素膜进行标记 10 分钟，然后用iBright成像仪对标记的膜进行成像。用同样经过免染型标记的膜，用一种用 Alexa Fluor 645 染料标记的特异性抗体检测 RB1。用 iBright 标准化软件对加样 HeLa 裂解液（0.6 至 10 µg）的泳道中的总蛋白信号以及 RB1免疫检测条带的信号强度进行定量。绘制总蛋白加样和 RB1 的信号强度曲线。
用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质
No-Stain 蛋白标记试剂在 10 分钟内与凝胶中的所有蛋白的赖氨酸侧链部分形成共价键。
- 它是传统凝胶染色试剂的绝佳替代品—无需脱色，可在各种蛋白质裂解液加样量（1-80µg）下实现精确标准化
- 灵敏——检测下限为20纳克/条带
- 特异——仅与蛋白质的赖氨酸侧链结合。游离标签不具有荧光性，因此可获得卓越的信噪比
- 灵活性——与任何凝胶类型兼容；无需更换凝胶即可获得免染型的便利性
下图4显示使用免染型蛋白标记试剂对印迹上的蛋白质进行标记，转移后呈线性且与加样蛋白质的量成比例。
图 4.膜上蛋白质的免染型标记信号响应呈线性。在 1 号泳道中，用 HeLa 裂解液（ 1 至 5050 µg）和 PageRuler 免染型蛋白质分子量标准加载 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型凝胶。使用 MES 运行缓冲液进行电泳后，使用 Invitrogen PowerBlotter 和 PowerBlotter Select Stacks 将蛋白质转移到 PVDF 膜上（10 分钟）。在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗 PVDF 膜两次，每次 2 分钟。向装有 PVDF 膜的皿中加入 10 ml 免染型标记溶液，启动免染型标记反应。在旋转平台上进行 10 分钟标记反应。然后在旋转平台上用 20 ml 超纯水清洗膜 3 次，每次 2 分钟。使用 iBright 成像仪，在免染型膜上设置曝光参数（455—485 nm 激发，565—615 nm 发射），然后拍摄图像。
定量凝胶染色
图 5 显示了使用免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质时，信号与蛋白质量的线性关系。
图 5.定量凝胶染色。将浓度为 2.5 至 80 µg 的HeLa 裂解液装入 4-12% 的 Bis-Tris Plus 小型凝胶，并用 MES 电泳缓冲液进行电泳。电泳后，按照凝胶中蛋白质标记的免染型蛋白质标记试剂盒的说明对凝胶中的蛋白质进行标记，并使用 iBright 成像仪对凝胶成像，该成像仪配有透射激发器（490-520 nm）和565-615 nm 发射滤光片。
免染型蛋白的信号强度随孵育时间增加
免染型蛋白标记试剂的灵敏度可以微调，以改善对低丰度蛋白的检测。使用免染型试剂延长凝胶或印迹的孵育时间，信号强度呈线性增加。或者，当时间有限时，将免染型蛋白标记试剂的浓度加倍，可在较短的标记时间内获得类似的结果。曝光时间可以轻松设置和调整，以适应实验条件，使用iBright成像系统，将方法检测能力扩展到更广泛的蛋白质表达水平。
点击图片放大
图 6：延长孵育时间可提高免染型标签试剂的灵敏度。转移的 PVDF（聚偏二氟乙烯）膜分别与免染型标签试剂孵育 10、20、30 和 40 分钟，随着时间的推移，信号强度增加。Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶上加载了 40至1.25 μg 的大肠杆菌裂解液，并使用 MES SDS 运行缓冲液进行电泳分离。使用 Invitrogen iBlot 2 凝胶转移装置和 iBlot 2 转移装置（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转移到小型 PVDF 膜上。用20 ml 超纯水快速冲洗 PVDF 膜，然后在旋转平台上用 10 ml 免染型蛋白标记试剂工作液进行孵育。在加入免染型蛋白标记试剂后 10、20、30 和 40 分钟，使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统采集印迹分析图像（曝光时间 1000 秒），未对图像进行亮度和对比度调整。曝光时间越长，信号越强，从而提高对低表达蛋白的检测能力（A）。可以观察到标准化信号强度与孵育时间呈线性相关（B）。
将免染型蛋白标记试剂的浓度加倍，信号强度会增强
点击图片放大
图7.将免染型标记试剂的浓度加倍可提高检测灵敏度。将 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶与 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 连续稀释液）一起加入 Bolt LDS 样品缓冲液中，然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质直接在凝胶上用 1 倍或 2 倍免染型试剂进行标记。1 倍免染型试剂根据免染型蛋白质标记试剂的标准方案制备。2 倍免染型蛋白质标记试剂通过将免染型活化剂（40μL）和免染型衍生剂（40μL）的浓度加倍制备。使用Invitrogen iBright FL1500成像系统（曝光时间1000秒）采集凝胶（A）和膜（B）的分析图像，未进行亮度和对比度调整。
免染型凝胶的免疫印迹
免染型蛋白标记试剂的多功能性延伸至蛋白质转移和免疫印迹。使用免染型试剂对蛋白质进行标记不会影响蛋白质转移效率，并且与下游蛋白质印迹法兼容，如图 8 所示。
点击图片以放大
图8.免染型标记试剂与蛋白质转移和免疫印迹兼容。将 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶与 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 连续稀释液）一起加入 Bolt LDS 样品缓冲液中，然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。将凝胶在旋转平台上与免染型蛋白标记试剂一起孵育 10 分钟。使用Invitrogen iBlot 2 凝胶转移装置和iBlot 2转移装置（P0 方案，7 分钟）将免染型标记的凝胶转移到 PVDF 膜上。然后使用特异性的一抗对 PVDF 膜进行检测，并使用标记有 Alexa 荧光 800 染料的二抗检测蛋白质。使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的分析图像。
灵敏度堪比考马斯染色，但所需时间更短
免染型蛋白标记试剂提供了一种快速、灵敏的方法，用于在凝胶和膜上可视化蛋白，无需冗长的脱色步骤和甲醇暴露。
点击图片放大
图9.免染型标记试剂的灵敏度与考马斯染色相当。将 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶与 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 连续稀释液）一起加入 Bolt LDS 样品缓冲液中，然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质条带用免染型蛋白标记试剂或考马斯亮蓝染料标记。使用Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的分析图像。此外，免染型图像的曝光时间可以增加，以便与考马斯蓝相比，更好地检测更低水平的裂解液。
免染型蛋白标记试剂与化学发光和荧光检测兼容。因此，您可以继续使用实验室已有的化学发光酶标二抗。在使用荧光抗体结合物设计实验时，重要的是选择与免染型标签的激发和发射光谱不重叠的荧光团，当免染型标签与赖氨酸残基共价结合时，在约 488 nm 光源激发下，在约 590 nm 处发光。荧光团的选择取决于荧光成像仪的滤光片组。
您可以将二级抗体荧光偶联物的激发和发射光谱与免染型标签的激发和发射光谱进行比较，以评估与当前抗体偶联物的兼容性。图 6 显示了共价结合的免染型标签的激发和发射光谱。
表 1.当使用免染型蛋白标记试剂与 iBright FL1500 成像系统时，兼容的荧光二抗。
点击放大图片
图 10.共价键连接的免染型标签的激发和发射光谱。共价键连接的免染型标签的激发最大值约为 488 nm，发射最大值为 590 nm。光谱显示，无污标签的信号可以使用紫外或荧光光源成像，并且可以使用各种发射滤光片捕获信号。
表1列出了在使用 iBright FL1500 成像系统成像时与共价连接的免染型标签兼容的荧光团的部分列表。任何共轭物都可以单独与无污标签和 iBright 成像仪一起使用。如果使用两种荧光团和无污蛋白质标记试剂进行多重标记，则从 600 nm 范围内选择一种荧光团，从 700 nm 范围内选择另一种荧光团，以便每种荧光团都可以通过不同的 iBright 发射滤光片成像。
表 1.与 iBright FL1500 成像系统一起使用免染型蛋白标记试剂时兼容的荧光二抗。
参考文献
- Paramanantham, A., Asfiya, R., Das, S., & Mccully, G. (2023)。No-stain protein labeling as a potential normalization marker for small extracellular vesicle proteins.（免染型蛋白质标记作为小细胞外囊泡蛋白质的潜在标准化标记。）Preparative Biochemistry & Biotechnology, 0(0), 1–11.
- Lazcano, P., Schmidtke, M. W., Onu, C. J., & Greenberg, M. L. (2022).(2022) Phosphatidic acid inhibits inositol synthesis by inducing nuclear translocation of kinase IP6K1 and repression of myo-inositol-3-P synthase。（磷脂酸通过诱导激酶 IP6K1 的核易位和抑制肌醇-3-P 合酶来抑制肌醇的合成。）Journal of Biological Chemistry, 298(9), 102363.
- Taylor, S. C., Murai, L. K. R., Crobeddu, B., & Plante, I. (2022).A critical path to producing high quality , reproducible data from quantitative western blot experiments.（从定量蛋白质印迹实验中获取高质量、可重复数据的有效途径。）Scientific Reports.
- Matassa, D. S., Criscuolo, D., Avolio, R., Agliarulo, I., Sarnataro, D., Pacelli, C., Scrima, R., Colamatteo, A., Matarese, G., & Capitanio, N. (2022).Regulation of mitochondrial complex III activity and assembly by TRAP1 in cancer cells.（TRAP1 对癌细胞中线粒体复合物 III 活性和组装的调节。）Cancer Cell International, 22(402), 1–18.
相关资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。