Search Thermo Fisher Scientific
20 世纪 70 年代中期，人们首次在组织化学应用中利用了生物素与亲和素的高亲和性。
这种卵清蛋白及其细菌对应物链霉亲和素自此成为各种检测方案的标准试剂。 最简单的这种生物素-亲和素检测方法是将生物素化探针应用到样品上，然后用标记的亲和素或链霉亲和素检测结合的探针。这些技术通常用于定位细胞和组织中的抗原，以及在免疫测定和DNA杂交程序中检测生物分子。 在某些应用中，固定化的亲和素用于捕获和释放生物素化的目标。除了我们的染料和酶结合物（亲和素和链霉亲和素）外，本部分还包含几种可用于亲和分离生物素结合分子及其在细胞和组织中的复合物的产品。
我们的各种生物素化试剂和生物素结合物在“生物素和脱硫生物素结合物—第 4.3 节”中进行了介绍。将我们的生物素化或 DSB-X 生物素标记的二抗（二抗免疫试剂—第 7.2 节，分子探针二抗结合物总结—表 7.1）与荧光染料或酶标记的亲和素结合，为间接检测各种动物来源的抗体提供了灵敏的方法。
生物素结合蛋白（包括亲和素、链霉亲和素和中性亲和素）每个分子都能以高亲和力和选择性结合四个生物素。据报道，链霉亲和素（S888）与生物素的解离速度比亲和素（A887、A2667）快约 30 倍。它们具有多个结合位点，可用于多种技术，其中未标记的亲和素、链霉亲和素或中性亲和素生物素结合蛋白可用于连接两种生物素试剂。这种桥接方法通常用于将生物素化探针与酶联免疫组织化学应用中的生物素化酶连接起来，通常可以消除使用直接亲和素或链霉亲和素酶结合物时可能出现的背景问题。然而，线粒体中存在具有羧化酶活性的内源性生物素化蛋白（
）；因此，为了在细胞中灵敏地检测生物素化靶标，需要使用生物素阻断剂来减少这种背景。 我们的内源性生物素阻断试剂盒（E21390，见下文）为该应用提供了试剂和操作规程。通过在缓冲液中添加额外的盐，而不是添加基于蛋白质的封闭试剂，可以更有效地阻止酶的亲和素结合物与硝酸纤维素的非特异性结合。
高纯度无标记的亲和素（A887）、链霉亲和素（S888）、中性亲和素生物素结合蛋白（A2666）和捕获亲和素生物素结合蛋白（C21385）均有大量现货供应。我们还提供特别包装的较小规格的亲和素，以方便使用（A2667）。我们的亲和素、链霉亲和素和脱糖基化中性亲和素生物素结合蛋白通常每毫克蛋白质结合超过 12 mg 生物素。
亲和素
亲和素（A887、A2667；分子探针亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素结合物—表 7.9）是一种高度阳性的 66000 Dalton 糖蛋白， 等电点约为 10.5。人们认为，亲和素的带正电荷的残基及其寡糖成分（主要由甘露糖和 N-乙酰葡糖胺组成的异质结构）可以与带负电荷的细胞表面和核酸发生非特异性相互作用，有时会在一些组织化学应用和流式细胞术中造成背景问题。目前已经开发出抑制这种非特异性亲和素结合的方法。 在某些情况下，也可以利用亲和素的非特异性结合。例如，亲和素及其结合物可选择性地与固定细胞制剂中啮齿动物和人类肥大细胞颗粒中的成分结合，可用于识别正常和患病人类组织中的肥大细胞，而无需生物素化探针。
链霉亲和素
链霉亲和素（S888，分子探针的抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素结合物—表 7.9）是一种非糖基化的 52800 Dalton 蛋白，具有接近中性的等电点，据称比抗生物素蛋白的非特异性结合更少。然而，链霉亲和素含有三肽序列Arg-Tyr-Asp（RYD），该序列显然模仿了纤维粘连蛋白的Arg-Gly-Asp（RGD）结合序列，而纤维粘连蛋白是细胞外基质的一种成分，可特异性促进细胞粘附。 这种通用的识别序列可与整合素和相关细胞表面分子结合。 链霉亲和素有时会出现的背景问题可能与这种三肽有关。我们特别观察到链霉亲和素和抗生物素 结合物在某些细胞中的线粒体结合（），可以用我们的内源性生物素阻断试剂盒（E21390,，见下文）中的试剂阻断。
中性亲和素生物素结合蛋白
我们提供了一种常用亲和素和链霉亲和素的替代品。我们的中性亲和素生物素结合蛋白（A2666，分子探针亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素结合物—表 7.9）结合物是一种经过处理去除碳水化合物并降低等电点的蛋白质，有时可以减少背景染色。据报告，用于脱糖基化的方法既能保留亲和素的特异性结合，又能保留其胺结合位点的互补性。中性亲和素结合物已被证明能够更好地检测中期染色体扩增中的单拷贝基因。
捕获亲和素生物素结合蛋白：生物素化分子的可逆结合
除了抗生物素蛋白、链霉亲和素和中性亲和素生物素结合蛋白外，我们还提供 CaptAvidin 生物素结合蛋白（C21385，分子探针抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性亲和素和 CaptAvidin 结合物—表 7.9）。亲和素四个生物素结合位点中的酪氨酸残基选择性硝化，可显著降低蛋白质对pH值高于 9 的生物素化分子的亲和力。 因此，生物素化探针可在中性 pH 值下吸附，并在 pH 值约为 10 时释放（图 7.6.10）。我们使用游离生物素来阻断任何未硝化的剩余高亲和力生物素结合位点。CaptAvidin 琼脂糖（C21386，见下文）对于从复杂混合物中分离和纯化生物素结合物特别有用。Captavidin 还提供了一种可再生的捕获试剂，用于表面等离子共振（SPR）免疫传感器的功能化。 CaptAvidin 衍生物的生物素结合能力通常为每毫克蛋白质至少 10 µg 游离生物素。
亲和素的二次检测
亲和素、链霉亲和素和中性亲和素结合物在组织化学应用（, ）、FISH（图 7.6.1）、流式细胞术、微阵列（图 7.6.2）和印迹分析中广泛用作二次检测试剂。这些试剂还可用于定位生物胞素、生物素乙二胺或任何荧光生物胞素—它们都是常用的生物素衍生物，可作为神经解剖示踪剂（极性示踪剂—第14.3 节）。
以下为常用的方法，将抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性亲和素生物素结合蛋白和捕食性抗生物素蛋白作为二级检测试剂：
- 直接法。将生物素化的抗体、单链核酸探针或凝集素等一抗与组织、细胞或其他表面结合。多余的蛋白质可通过洗涤去除，检测则通过荧光亲和素、链霉亲和素或中性亲和素生物素结合蛋白（
- 捕获和释放。我们独特的 DSB-X 生物素技术（抗生物素蛋白-生物素和抗体-半抗原技术简介—第 4.1 节）允许通过亲和素和链霉亲和素结合物对 DSB-X 生物素衍生物进行完全可逆的标记。
- 桥接方法。使用生物素化抗体或寡核苷酸探查组织、细胞或其他表面，然后用未标记的抗生物素蛋白、链霉亲和素或中性亲和素生物素结合蛋白处理该制剂。通过洗涤去除多余的试剂，然后用生物素化检测试剂进行检测，例如荧光生物素或生物胞素染料（生物素和脱硫生物素结合物—第 4.3 节）、生物素化 R-藻红蛋白
- 间接法。将未标记的一抗与细胞结合，然后用生物素化的物种特异性二抗。洗涤后，通过上述两种方法之一检测复合物。我们的 Zenon 生物素 XX 抗体标记试剂盒（Zenon 技术：免疫标记通用试剂—第 7.3 节，Zenon抗体标记试剂盒—表 7.7）可对抗体进行快速、定量的生物素化，以便与亲和素-生物素检测方法结合使用。
 | 图 7.6.1 通过酪氨酸信号放大检测荧光原位杂交。从培养的纤维母细胞系 MRC-5 制备染色体扩增物，并与特异性针对 17 号染色体的生物素化 α-卫星探针杂交。该探针是在生物素化 dUTP 存在的情况下通过缺口翻译产生的。为了通过 TSA 检测，杂交染色体涂片可通过以下两种方法进行标记：A）使用 TSA 试剂盒 #22（T20932）与 HRP 结合的链霉亲和素和 Alexa Fluor 488 酪胺；B）使用 TSA 试剂盒# 23（T20933）与 HRP 结合的链霉亲和素和 Alexa Fluor 546 酪胺。用 DAPI（D1306、D3571、D21490）进行复染后，使用适合 DAPI、FITC 或 TRITC 的滤光片获得图像。 |
 | 图 7.6.2 R-藻红蛋白用于检测微阵列上的 DNA。含有稀释的小牛胸腺 DNA 的 DNA 微阵列与生物素化的 DNA 探针杂交，然后与 R-藻红蛋白-链霉亲和素（SAPE；SS866，S21388）孵育。清洗后，使用三种不同的检测配置在 Packard ScanArray 5000 上检测荧光信号：488 nm 激发（氩离子激光）/570 nm 发射滤光片（左）；543.5 nm 激发（氦氖激光）/570 nm 发射滤光片（中）；543.5 nm 激发（氦氖激光）/592 nm 发射滤光片（右）。 |
内源性生物素和生物素酶
哺乳动物细胞和组织中含有生物素依赖的羧化酶，而这种羧化酶是各种代谢功能所必需的。当使用亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素检测系统识别细胞靶标时，这些含生物素的酶通常会产生大量背景信号
（
）。内源性生物素在线粒体以及肾脏、肝脏和大脑组织中尤为常见。 在哺乳动物血清和血浆中，生物素化蛋白易被内源性生物素酶分解，产生游离生物素和未标记的蛋白。
内源性生物素阻断试剂盒（E21390）中的试剂可用于最大程度地减少这些技术中内源性生物素的干扰。该试剂盒提供链霉亲和素和生物素溶液，装在方便的滴管瓶中，并附有简单易懂的说明书（内源性生物素阻断试剂盒）。试剂盒中提供了足够材料，可供约一百个 18 mm × 18 mm 的玻璃盖玻片使用。
荧光标记的亲和素、链霉亲和素和中性亲和素生物素结合蛋白
荧光亲和素和链霉亲和素广泛用于DNA杂交技术、,免疫组织化学（）、MHC 四聚体技术（MHC四聚体技术—备注 7.2）和多色流式细胞术。 随着新型荧光团和信号放大技术的不断推出（分子探针亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素结合物—表 7.9），我们提供的亲和素、链霉亲和素和中性亲和素结合物的种类也在不断增加。我们继续提供荧光素（A821、S869、A2662）、四甲基罗丹明（S870、A6373）、罗丹明B（S871）和德克萨斯红（A820、S872、A2665、S6370）染料的亲和素、链霉亲和素和中性亲和素结合物。然而，我们强烈建议研究人员评估我们许多更新的荧光结合物：
- 绿色荧光 Alexa Fluor 488 和 Oregon Green 结合物不仅比荧光素结合物更亮，而且光稳定性更高（图 7.6.3），对pH值的敏感性更低（跨越可见光和红外光谱的 Alexa Fluor 染料——第 1.3 节）。
- 橙色和橙红色的荧光染料 Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568 和罗丹明红-X 染料，以及红色荧光染料 Alexa Fluor 594 和 Texas Red-X 染料比传统的罗丹明 B 和 Texas Red 结合物更具有荧光性，但具有相似的激发和发射最大值。
- Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、 Alexa Fluor 750和Alexa Fluor 790 结合物具有肉眼看不见的荧光，但它们能够被激光光源有效激发，并且其荧光很容易被红外光敏感探测器检测到。特别是 Alexa Fluor 555 和 Alexa Fluor 647 染料的结合物，其荧光分别优于光谱相似的Cy3和 Cy5 染料
- 在并排测试中，蓝色荧光 Alexa Fluor 350 链霉亲和素（S11249）的荧光强度明显高于AMCA链霉亲和素（图 7.6.5）。蓝色荧光 Alexa Fluor 405 链霉亲和素（S32351）和太平洋蓝链霉亲和素（S11222）、绿色荧光太平洋绿链霉亲和素（S11200）、黄色荧光 Cascade 黄链霉亲和素（S11228）和橙色荧光太平洋橙链霉亲和素（S32365）在 400 至 410 nm 波长范围内吸收能力最强，因此它们接近 （S11228）和橙色荧光太平洋橙链霉亲和素（S32365）在 400 至 410 nm 波长范围内吸收率最高，与用于荧光显微镜和流式细胞仪的 405 nm 紫激光几乎完美匹配。
- 链霉亲和素（SAPE；S866、S21388）和中性亲和素生物素结合蛋白（A2660）的 R-藻红蛋白（R-PE）结合物以及链霉亲和素（S32350）的 B-藻红蛋白（B-PE）结合物比我们的有机染料结合亲和素亮得多。我们已将 R-PE 和 B-PE 的链霉亲和素结合物纯化，以确保去除所有未结合的链霉亲和素（图 7.6.6），使其成为多色流式细胞仪（藻胆蛋白—第 6.4 节）中特别重要的标记物。
此外，我们已将R – PE与我们四种Alexa Fluor染料偶联，这四种染料分别是Alexa Fluor610、Alexa Fluor647、Alexa Fluor680与Alexa Fluor750染料，然后将这些串联标记偶联至链霉亲和素，产生可在488 nm的氩离子激光器谱线下激发的标记偶联物。Alexa Fluor 610–R-PE 结合物（S20982)）的长波长发射最大值为 628 nm，Alexa Fluor 647–R-PE 结合物（S20992)、Alexa Fluor 680–R-PE 结合物（S20985）的发射波长为 702 nm，Alexa Fluor 750–R-PE 结合物（S32363）的发射波长为 775 nm。与 R-PE 的 Texas Red 结合物相比，Alexa Fluor 610–R-PE 结合物的发射波长向更长波长移动了约 13 nm（图 7.6.7），显著提高了多色流式细胞仪的分辨率。Alexa Fluor 647-R-PE 串联结合物的光谱与 R-PE 的 Cy5 结合物几乎相同，但荧光强度是其三倍左右（图 7.6.8）。我们还将异藻黄素（APC）与三种 Alexa Fluor 染料（Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700 和 Alexa Fluor 750 染料）结合，然后将这些串联标记与链霉亲和素（S21002、S21005、S21008）结合。所得探针均可被 633 nm 的氦氖激光或 647 nm 的氪离子激光激发，并具有可区分的发射光谱。我们目前提供的荧光素、酶和金标记的亲和素、链霉亲和素和中性亲和素生物素结合蛋白的完整列表，请参见分子探针亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素结合物—表 7.9。
 | 图 7.6.3 绿色荧光染料 Alexa Fluor 488、Oregon Green 488 和荧光素染料的耐光漂白性，通过激光扫描细胞计数法测定。EL4 细胞用生物素结合的抗 CD44 抗体标记，然后用 Alexa Fluor 488（S11223）、Oregon Green 488（S6368）或荧光素（S869）链霉亲和素（亲和素、链霉亲和素、中性亲和素 和 CaptAvidin生物素结合蛋白和亲和基质—第 7.6 节）检测。然后将细胞固定于 1% 的甲醛溶液中，清洗并湿式贴片。贴片后，在激光扫描细胞仪上对细胞进行 10 次扫描；氩离子激光488纳米光谱线的激光功率为 25 mW。扫描持续时间约为 5 分钟，每次重复扫描均在前一次扫描完成后立即开始。数据以百分比表示，由每次扫描的平均荧光强度（MFI）除以第一次扫描的 MFI 得出。数据由国家癌症研究所实验移植和免疫学部门 Bill Telford 提供。 |
 | 图 7.6.4 通过激光扫描细胞仪测定的红色荧光染料 Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 633、PBXL-3 和 Cy5 以及异藻黄素荧光蛋白的耐光漂白性。EL4 细胞用生物素结合的抗 CD44 抗体标记，并用 Alexa Fluor 647（S21374）、Alexa Fluor 633（S21375）、PBXL-3、Cy5 或异胞藻蛋白（APC, S868）链霉亲和素检测。然后，细胞用 1% 的甲醛固定、洗涤并湿式封片。贴片后，细胞在激光扫描细胞仪上扫描 8 次；He-Ne 激光 633 nm 光谱线的激光功率为 18 mW。扫描持续时间约为 5 分钟，每次重复在完成前一次扫描后立即开始。数据以百分比表示，由每次扫描的平均荧光强度（MFI）除以第一次扫描的 MFI 得出。数据由国家癌症研究所实验移植和免疫学部门 Bill Telford 提供。 |
 |
|
）和磺化 AMCA 衍生物Alexa Fluor 350 链霉亲和素（
）的相对荧光比较。偶联物的荧光值是通过测定偶联的染料相对游离的染料的荧光量子产率，再乘以每蛋白单位的荧光团数量而决定。 |
|
图7.6.7 Alexa Fluor 610-R-藻红蛋白链霉亲和素（S20982，红色）和 Texas Red 染料-R-藻红蛋白链霉亲和素（蓝色）串联结合物的荧光发射光谱。A.）在激发波长（488 nm）等吸收值的条件下，样品的相对荧光强度分级的谱图比较；B) 为了便于比较光谱曲线，将相同数据标准化为相同的峰值强度值。
图 7.6.8 Alexa Fluor 647–R-藻红蛋白链霉亲和素（S20992；红色）和 Cy5–R-藻红蛋白链霉亲和素（蓝色）串联结合物的荧光发射光谱。A) 在激发波长（488 nm）下，以相对荧光强度为尺度，对吸光度相同的样品进行光谱比较。B) 为了便于比较光谱曲线，将相同数据标准化为相同的峰值强度值。
链霉亲和素、中性亲和素和生物素标记的荧光微球
我们提供链霉亲和素、中性亲和素和生物素结合物，以及各种颜色和大小的强荧光聚苯乙烯微球 FluoSpheres 和 TransFluoSpheres，包括铕和标记有中性亲和素生物素结合蛋白的铕和铂发光微球，用于时间分辨荧光测定（分子探针铕和铂发光微球—表 14.8）。由于可以检测单个荧光微球，因此 FluoSpheres 和 TransFuoSpheres 微球在超灵敏流式细胞仪应用和免疫测定方面具有巨大潜力。 它们也可以用作示踪剂，可通过标准的酶促组织化学方法检测（用于示踪的微球和 Qdot 纳米晶—第 14.6 节）。
BlockAid封闭液（B10710）是一种蛋白质试剂，主要用于与链霉亲和素、中性亲和素和生物素标记的荧光微球（生物素、链霉亲和素和中性亲和素生物 蛋白结合蛋白标记的荧光微球—表 6.8）以及链霉亲和素和中性亲和素标记的 TransFluoSpheres 微球（TransFluoSpheres 荧光微球摘要—表 6.9）。蛋白质和其他大分子标记的微球具有疏水区域，在某些实验系统中可能会导致它们与非目标表面结合。虽然这种非特异性结合通常可以通过使用封闭液来缓解，但我们发现微球需要比常用封闭液更强的封闭液。在我们的测试中，将 BlockAid 封闭液与链霉亲和素标记的荧光微球混合，然后用于对几种不同类型的细胞进行染色，以便随后通过流式细胞术进行分析。我们发现 BlockAid 封闭液优于其他市售封闭液以及科学文献中描述的几种标准封闭液，能够减少标记微球的非特异性结合。BlockAid 封闭解决方案在 NIH 3T3、A431、RAW 和 Jurkat 细胞系流式细胞仪应用中表现出了有效性；然而，在 HMC-1 细胞系中，它似乎并没有比标准封闭解决方案更具优势。我们预计，BlockAid 封闭液将有助于减少蛋白质涂层或其他大分子涂层微球在各种流式细胞仪和显微镜应用中的非特异性结合。
Qdot 链霉亲和素结合物
Qdot 链霉亲和素结合物结合了链霉亲和素的高度特异性结合特性和 Qdot 纳米晶体（Qdot 纳米晶体—第 6.6 节）的卓越光稳定性。Qdot 纳米晶体具有较大的表面积，可将多个链霉亲和素分子同时结合到单个荧光团上。这种方法的优势包括提高对靶标的亲和力、在某些情况下可能发生协同结合以及使用有效的信号放大方法。例如，将生物素功能化产品与链霉亲和素标签结合，可以在初始标记步骤后通过"夹心法"（链霉亲和素/生物素/链霉亲和素等）连续增强信号。
这些功能强大的荧光检测试剂在各种组织标记和流式细胞仪实验中具有独特的性能优势；它们能够有效地利用 405 nm 紫激光激发，而且 Qdot 纳米晶体荧光对光漂白具有极强的抵抗力。用 Qdot 纳米晶体染色的组织不仅可观察数小时，而且这些染色组织可永久存档；对妥善保存的存档样本进行重新分析时，定量结果与初始检测结果相同。
我们选择的 Qdot 链霉亲和素结合物均可由单一激发源激发，从而可通过滤色法轻松地对单个样本中的多个目标或事件进行多色分析，以分辨各个信号：
核酸杂交可通过末端生物素化的寡核苷酸与 Qdot 链霉亲和素结合物的复合来检测。 Qdot 链霉亲和素结合物与生物素化抗体结合，可在成像和流式细胞仪平台上提高蛋白质免疫检测的多重检测能力。分子运动的单粒子追踪是 Qdot 链霉亲和素结合物的一项特别引人注目的应用，它利用了 Qdot 链霉亲和素结合物卓越的荧光能力。 这些测量的主要对象是细胞表面受体和分子马达，如肌球蛋白。 单分子检测揭示了分子运动和组装的细节，这些细节被大量测量的平均效应所掩盖。Qdot 纳米晶体在这种应用中非常重要，因为荧光光子输出最终会影响到测量的空间和时间分辨率。
通常情况下，使用生物素化的配体（如生物素化表皮生长因子（E3477，生物素和脱硫生物素结合物—第 4.3 节）和生物素-XX α-bungartoxin（B1196，生物素和脱硫生物素结合物—第 4.3节））将 Qdot 链霉亲和素结合物与受体结合，从而完成标记。由于这些结合物在每个 Qdot 纳米晶体上结合了多个链霉亲和素（通常为 5-10 个），因此必须仔细注意链霉亲和素与配体的化学计量比，以避免 Qdot 链霉亲和素-生物素化配体复合物介导的受体交联。 链霉亲和素-生物素化配体的摩尔过量 Qdot 结合物会使复合物的化学计量比偏向于每个纳米晶体一个配体的理想结果。Qdot 链霉亲和素结合物以 1 µM 溶液的形式提供，溶液中包含 50 mM 硼酸盐、pH 8.3、0.05% 叠氮化钠和 1 M 甜菜碱抗冻剂，每份 200 µL。Qdot 链霉亲和素采样器试剂盒（Q10151MP）在一个包装中提供 50 µL 六种不同的Qdot链霉亲和素结合物。
我们还提供 Qdot ITK 链霉亲和素量子点，其中链霉亲和素直接附着在内侧两亲性涂层上，无需 PEG 连接剂。与聚乙二醇连接的复合物相比，这种配方的总体粒径更小，每个纳米晶体上的链霉亲和素数量更多。这些特性在荧光共振能量转移（FRET）检测中非常有用，可用于检测目标核酸序列与Qdot纳米晶体表面捕获的生物素化寡核苷酸的杂交情况。 Qdot ITK 链霉亲和素结合物在Qdot纳米晶体—第 6.6 节中进行了描述。
亲和素和链霉亲和素的酶结合物广泛用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、印迹技术、原位杂交以及细胞化学和组织化学。 使用这些结合物的酶介导原位技术比放射性方法具有更高的分辨率、更安全、更灵敏、更快速。最常用的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和大肠杆菌 β-半乳糖苷酶，因为它们具有高周转率、稳定性、易结合和成本相对较低的特点。
我们利用链霉亲和素和生物素结合蛋白中性亲和素的酶结合物，通过技术手段使酶与亲和素类似物的比例接近 1:1，从而最大限度地保持酶和载体蛋白的活性。我们已制备了高活性的链霉亲和素和生物素结合蛋白中性亲和素结合物，包括辣根过氧化物酶（S911，A2664）、碱性磷酸酶（S921）、β-半乳糖苷酶（S931）和 β-内酰胺酶 TEM-1（S31569）。这些酶的荧光、显色和化学发光底物在酶底物和测定—第 10 章中描述。为了减少背景问题，研究人员通常更喜欢使用生物素-XX 结合物的辣根过氧化物酶（P917）与亲和素或链霉亲和素桥结合，用于间接检测各种生物素化的生物分子。
HRP 和碱性磷酸酶结合物的主要应用是亲和素和辅助抗体的酶促细胞和组织化学染色。TSA 和其他过氧化物酶信号放大技术—第 6.2 节 中的几种酪胺信号放大（TSA）试剂盒—表 6.1 以及磷酸酶信号放大技术—第 6.3 节 中的酶标记荧光（ELF）试剂盒利用链霉亲和素的酶结合物对细胞靶标进行强荧光染色（图 7.6.1、图 7.6.9）。这些试剂盒对于免疫荧光、原位杂交和流式细胞术非常有用。TSA 和 ELF 技术的组合使用或 TSA 方法的重复应用可提高对低丰度靶标的检测灵敏度。
图 7.6.9 直接或通过信号放大检测表皮生长因子（EGF）受体。表达高（A431 细胞，A 组）和低（NIH 3T3 细胞，B 组）水平 EGF 受体的细胞，要么直接用预制的生物素化表皮生长因子（E13345，蓝色）的Alexa Fluor 488 复合物标记，要么间接用生物素化 EGF（E3477）标记，然后使用 Alexa Fluor 488 链霉亲和素（S11223，绿色）或 HRP 结合链霉亲和素和 Alexa Fluor 488。 （E3477）进行间接标记，然后使用Alexa Fluor 488 链霉亲和素（S11223，绿色）或 HRP 结合链霉亲和素和 Alexa Fluor 488 抗生物素蛋白（紫色），它们都是 TSA 试剂盒 #22（T20932）的组成部分。
NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 链霉亲和素
我们与 Nanoprobes 公司（www.nanoprobes.com）合作，提供 NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 链霉亲和素结合物，以促进免疫印迹、光学显微镜和电子显微镜的应用。NANOGOLD 结合物与 1.4 nm NANOGOLD 金簇标签共价结合，而 Alexa Fluor FluoroNanogold 结合物则与 NANOGOLD 标签和 Alexa Fluor 488 或 Alexa Fluor 594 荧光团结合，分别形成具有绿色或红色荧光的金簇。Alexa Fluor FluoroNanogold 链霉亲和素结合物具有 NANOGOLD 结合物的所有优点，此外，它们还可用于相关荧光、光学和电子显微镜（）。
与胶体金相比，NANOGOLD 金簇具有多项优势。与大多数金胶体相比，它们与银的相互作用更强，因此灵敏度更高。 下文将介绍 LI Silver Enhancement Kit（L24919）等系统中银增强功能。此外，NANOGOLD 颗粒对蛋白质的亲和力不如金胶体，从而减少了非特异性结合引起的背景。NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 结合物的其他几个特点包括：
- NANOGOLD 金簇是一种极其均匀（直径 1.4 nm±10%）且稳定的化合物，而非金胶体。
- NANOGOLD 金簇比完整的 IgG（H+L）抗体小，大约是 Fab 片段大小的 1/15，因此能够更好地穿透细胞和组织，到达较大金颗粒结合物无法到达的抗原。
- NANOGOLD 结合物绝对不含聚集物，因为它们是通过凝胶过滤柱色谱纯化的。这一特性与胶体金结合物形成鲜明对比，后者通常通过离心法去除最大的聚集物，但经常含有明显更小的聚集物。
- NANOGOLD 颗粒与 Fab 片段的比率接近 1:1，这使其与大多数胶体金-抗体制剂的 0.2-10 可变化学计量比截然不同。
NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 产品可用于免疫印迹、光学显微镜和电子显微镜。标准免疫染色方法可成功用于 NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 免疫试剂。此外，由于抗体和金的浓度与大多数商业胶体金抗体制剂相似，因此稀释度和封闭剂也相似。
我们还提供其他几种 NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 试剂（NANOGOLD、Alexa Fluor FluoroNanogold 和胶体金结合物—表 7.5），包括亲和纯化的山羊抗小鼠 IgG 和抗兔 IgG 抗体 Fab 片段，它们与 1.4 nm NANOGOLD 金簇标签共价结合（二次免疫试剂—第 7.2 节）。此外，我们还提供 NANOGOLD 单马来酰亚胺（N20345，用可见光激发的巯基反应探针—第 2.2 节），它可与巯基结合，就像染料与蛋白质和核酸结合一样。
胶体金复合物
我们提供 Alexa Fluor 488 染料标记的胶体金结合物，包括山羊抗小鼠 IgG（A31560、A31561；二抗—第 7.2 节）和山羊抗兔 IgG 抗体（A31565、A31566；二抗—第 7.2 节）和链霉亲和素（A32360、A32361；分子探针的抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素结合物—表 7.9）。这些结合物吸附在 5 nm 或 10 nm 的胶体金上，可用作免疫印迹、光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜的探针。这些结合物的荧光很容易通过标准技术检测出来，但使用银增强方法可以大大提高胶体金的可视化效果，例如我们在《二次免疫试剂—第 7.2 节》中介绍的 LI 银增强试剂盒（L24919）中提供的那些方法。
将荧光二级检测试剂与胶体金结合形成功能性复合物非常困难，因为荧光染料（如荧光素）的荧光会因靠近胶体金而显著减弱。 我们使用 Alexa Fluor 488 染料制备荧光胶体金复合物，这种染料具有卓越的亮度和光稳定性。我们的 Alexa Fluor 488 染料标记的抗 IgG抗 体和链霉亲和素胶体金复合物可用于进行相关的免疫荧光和电子显微镜 检查，只需两步标记程序，而传统的非荧光抗 IgG 抗体或链霉亲和素胶体金复合物则需要三步间接标记程序。
链霉亲和素琼脂糖
我们制备了与 4% 珠状交联琼脂糖（S951）结合的链霉亲和素——这种基质可用于分离生物素化肽、蛋白质、杂交探针、半抗原和其他分子。 此外，生物素化抗体可与链霉亲和素琼脂糖结合，形成亲和基质，用于大规模分离抗原。 例如，将经过星形孢菌素处理的肌管与生物素化的 α-bungarotoxin（B1196，神经递质受体探针——第16.2节）一起孵育，以便在链霉亲和素琼脂糖上分离乙酰胆碱受体（AChRs），并评估星形孢菌素对该受体磷酸化程度的影响。 链霉亲和素琼脂糖还被用于研究细胞表面蛋白的周转，这些蛋白先前已被胺反应生物素（B1582，生物素化和半抗原化试剂—第 4.2 节）衍生化。
捕获抗生物素蛋白琼脂糖
捕获抗生物素蛋白琼脂糖（C21386）是另一种多功能生物素结合蛋白，其与生物素化分子的亲和力可通过将 pH 值提高到 10 而完全逆转，从而轻松地将生物素标记的分子从复杂的混合物中分离和分离（图 7.6.10）。这种琼脂糖固定化的生物素结合蛋白已被用于从全兔血清中纯化免疫球蛋白，以及直接从兔抗血清中分离抗转铁蛋白抗体。
 | 图 7.6.10 亲和色谱中 CaptAvidin 琼脂糖（C21386）的使用示意图。以生物素化的 IgG 分子和目标抗原为例。 |
用于将亲和素固定在聚合物上的丙烯酰胺结合物
链霉亲和素丙烯酰胺（S21379）由6-（（N-丙烯酰）氨基）己酸（丙烯酰-X，SE；A20770，化学交联试剂—第 5.2 节）的琥珀酰亚胺酯制备而成，是一种可用于制备生物传感器的试剂。 类似的链霉亲和素丙烯酰胺已被证明可在聚合物表面与丙烯酰胺共聚，形成一层均匀的固定化蛋白质单层。链霉亲和素可以结合生物素化的配体，包括生物素化的杂交探针、酶、抗体和药物。
亲和素对生物素的高亲和性最早在20世纪70年代初的细胞化学应用中被利用。 此后，尽管人们也认识到这种方法的局限性，但亲和素-生物素技术仍被广泛用于各种检测方案。 作为亲和素试剂的替代品，我们提供了一种高亲和力的生物素小鼠单克隆抗体（03-3700）。这种抗生物素抗体可用于免疫组织化学、原位杂交、酶联免疫吸附试验和流式细胞术等应用中检测生物素化分子。
研究表明，某些生物素单克隆抗体具有与抗生物素蛋白和链霉亲和素相似的生物素结合基序。 抗生物素抗体已被证明能够选择性染色线粒体脂肪酸合成中使用的内源性生物素依赖性羧化酶蛋白。 标记的抗生物素蛋白和抗生物素抗体对线粒体蛋白的非特异性染色可能会在使用抗生物素蛋白-生物素技术时产生复杂因素（）。这种非特异性结合通常可以通过用我们内源性生物素阻断试剂盒（E21390，亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素生物素结合蛋白和亲和基质—第 7.6 节）中的试剂对样品进行预处理来阻断。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。