荧光和生物素化葡聚糖 - 第 14.5 节

本页内容

• Molecular Probes 葡聚糖偶联物的特性
• 在细胞中导入葡聚糖及后续组织处理
• 用葡聚糖进行神经元示踪
• 用葡聚糖进行细胞谱系示踪
• 用葡聚糖研究细胞间通讯
• 用葡聚糖探测膜可透过性
• 与葡聚糖进行内吞作用后
• 用葡聚糖示踪液体运输
• 订购信息

葡聚糖是亲水性多糖，特征为具有中等至高分子量，水溶性良好，毒性较低。它们被广泛用作神经元 的顺行和逆行示踪剂，并被用于许多其他应用。由于它们较不常见的聚-(α-D-1,6-葡萄糖) 连接（使它们能够耐受大多数内源性细胞糖苷酶的裂解），葡聚糖具有生物惰性。葡聚糖通常也具有低免疫原性。

我们提供涵盖多个分子量范围的超过 100 种荧光和生物素化葡聚糖偶联物。由于葡聚糖的来源、分子量、净电荷、取代度和染料的性质可能显著影响其应用，因此引用 Molecular Probes 葡聚糖的参考文献可能不适用于从其他来源获得的葡聚糖，应将其视为参考指南，而非明确方案。在大多数情况下，Molecular Probes 荧光葡聚糖比其他来源的葡聚糖更亮且负电荷更高。此外，我们采用严格的方法去除尽可能多的未偶联染料，然后通过薄层色谱法检测我们的葡聚糖偶联物，以确保不存在低分子量的污染物。

多种取代基选择

Molecular Probes 葡聚糖与生物素或多种荧光基团偶联，包括我们的七种 Alexa Fluor 染料 （Molecular Probes 葡聚糖偶联物 - 表 14.4）。特别是，我们想特别强调 Alexa Fluor 488、Oregon Green 和 Rhodamine Green 染料的葡聚糖偶联物，这些偶联物比大多数荧光素葡聚糖更明亮且光稳定性更好。其他章节中介绍了钙离子和镁离子（荧光 Ca2+ 指示剂偶联物 - 第 19.4 节）和 pH 值（pH 值指示剂偶联物 - 第 20.4 节）的葡聚糖偶联荧光指示剂。

葡聚糖大小：

Molecular Probes 葡聚糖的标称分子量包括 3000；10,000；40,000；70,000；500,000；和 2,000,000 道尔顿（Molecular Probes 葡聚糖偶联物 - 表 14.4）。由于未标记的葡聚糖是多分散的，并且在其修饰和纯化过程中可能变得更加多分散，因此特定样品中实际存在的分子量可能具有较宽的分布。例如，我们的 "3000 MW" 葡聚糖制剂含有分子量主要在 ~1500 – 3000 道尔顿范围内的聚合物，包括染料或其他标记。

Molecular Probes 葡聚糖的取代度

其他商业来源的葡聚糖通常在 10,000 MW 范围内具有每个葡聚糖分子为 0.2 或更少染料分子的取代度。但是，Molecular Probes 的葡聚糖通常在 3000 MW 范围内每个葡聚糖分子含有 0.3–0.7 个染料分子，在 10,000 MW 范围内含有 0.5–2 个染料分子，在 40,000 MW 范围内含有 2–4 个染料分子，在 70,000 MW 范围内含有 3–6 个染料分子。产品标签上标明了实际取代度。如果过多荧光基团与葡聚糖分子偶联，可能会发生淬灭以及与细胞组分的不理想的相互作用。我们发现，我们的取代度对大多数应用来说是最佳的，所产生的葡聚糖通常比其他来源的标记葡聚糖更具荧光效果，因此可以使用更少的量进行细胞内示踪

据报告，一些市售荧光素异硫氰酸盐 (FITC) 葡聚糖由于存在游离染料或金属污染，因而在内吞作用研究中可产生假结果。 为了克服这一问题，我们通过将沉淀、透析、凝胶过滤和其他技术结合，尽可能地去除了游离染料。然后，通过薄层色谱 (TLC) 检测荧光葡聚糖，以确保其不含低分子量染料。我们制备了几种独有的产品，它们有两种甚至三种不同的标记，包括如下所述的 fluoro-ruby ， mini-Ruby 和 micro-ruby 葡聚糖。预计，在这些产品中，并非所有个体葡聚糖分子都拥有所有取代基，或具备相同的固定性，尤其是在最低分子量葡聚糖的偶联物中。

葡聚糖净电荷和取代基方法

葡聚糖的净电荷取决于荧光基团和制备偶联物的方法。我们大多数的 Molecular Probes 葡聚糖是通过将水溶性氨基葡聚糖（D1860、D1861、D1862、D3330、D7144）与适当染料的琥珀酰亚胺酯反应制备的，而不是通过将天然葡聚糖与异硫氰酸酯衍生物（如 FITC）反应。这种方法提供了极佳的氨基选择性，并形成酰胺键，后者在某种程度上比由异硫氰酸酯形成的相应硫脲更稳定。除 Rhodamine Green 和 Alexa Fluor 488 偶联物外，加入染料后，会给葡聚糖上未反应的胺基加盖，从而产生中性或阴离子葡聚糖。对于 Rhodamine Green 和 Alexa Fluor 488 葡聚糖，在染料偶联后，不会对葡聚糖上未反应的氨基加盖。因此，这些葡聚糖偶联物可能是中性、阴离子或阳离子。Alexa Fluor、Cascade Blue、荧光黄、荧光素和 Oregon Green 葡聚糖本质为阴离子，而大多数标记两性离子罗丹明 B、四甲基罗丹明和 Texas Red 染料的葡聚糖本质为中性。为了生产更高阴离子性的葡聚糖，我们开发了一种专有方法，将负电荷基团添加到葡聚糖载体上；这些产品被命名为"多阴离子"葡聚糖。

葡聚糖固定能力

某些应用需要用甲醛或戊二醛处理葡聚糖示踪剂，以便用于后续分析： 对于这些应用，我们提供大多数荧光基团或生物素葡聚糖偶联物的 "赖氨酸可固定" 版本。这些葡聚糖具有共价结合的赖氨酸残基，允许葡聚糖示踪剂通过醛介导的固定与周围生物分子结合，通过免疫组织化学和超微结构技术进行后续检测。我们还证明，我们还证明我们所有的 10,000 MW Alexa Fluor 葡聚糖偶联物均可用醛类固定剂固定；但是，由于其大小较小，我们的 Alexa Fluor 3000 MW 葡聚糖偶联物很可能不会在固定步骤中存活。

除非通过内吞过程被摄取，否则葡聚糖偶联物具有膜不可透过性，通常必须采用相对侵入性的技术导入 (分子导入细胞质的技术 - 表 14.1)。与《膜标记示踪剂 - 第14.4节》中的脂溶性示踪剂类似，葡聚糖偶联物的晶体已通过简单地将其直接放置在某些类型的样品上成功导入。 我们发现，Influx 内吞细胞导入试剂（I14402，螯合物、校准缓冲液、离子载体和细胞导入试剂 - 第 19.8 节）可用于将葡聚糖导入至多种贴壁和非贴壁细胞中。 在与活细胞一起使用之前，强烈推荐对葡聚糖溶液进行无菌过滤。 一些植物细胞可通过内吞途径摄取分子量高达 >100,000 道尔顿的生物素和生物素化生物。

我们的赖氨酸可固定葡聚糖和 10,000 MW Alexa Fluor 葡聚糖可与甲醛或戊二醛固定到位，支持后续组织处理，如切片。已发表了一项方案，用于将组织包埋在塑料中，对填充赖氨酸可固定荧光葡聚糖的神经元进行高分辨率表征。 生物素化或荧光葡聚糖的固定还可以使用荧光标记或酶标记的亲和素和链霉亲和素偶联物（亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 生物素结合蛋白及亲和基质 - 第 7.6 节，Molecular Probes 亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 偶联物 - 表 7.9），或抗染料抗体（抗染料和抗半抗原抗体 - 第 7.4 节，抗荧光基团和抗半抗原抗体 ­- 表 7.8）。这些技术可以放大信号，这对检测切片中的精细结构或改变检测模式非常重要。 我们提供可结合 Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 405/Cascade Blue、荧光黄、荧光素、BODIPY FL、四甲基罗丹明和 Texas Red 荧光基团以及 2，4- 二硝基苯 (DNP) 和硝基酪氨酸半抗原（ 抗染料和抗半抗原抗体 - 第 7.4 节）的抗体。

在二氨基联苯胺 (DAB) 存在的情况下，使用二氨基联苯胺 (DAB) 组织化学试剂盒（第二抗免疫试剂 - 第 7.2 节，亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 生物素结合蛋白及亲和基质 - 第 7.6 节）对用赖氨酸可固定荧光葡聚糖标记的神经元进行光转换可以产生用于电子显微镜观察的电子致密产物（荧光探针用于二氨基联苯胺试剂的光转换 - 注释 14.2）。 电子致密产物也可以从亲和素、链霉亲和素或抗染料抗体的过氧化物酶或胶体金偶联物中生成。 NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 二抗偶联物（二抗免疫试剂 - 第 7.2 节）和链霉素亲和素（亲和素、链霉素亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 生物素结合蛋白和亲和基质 - 第 7.6 节）可用于通过光学显微镜检测固定细胞制备物中的标记葡聚糖，或通过电子显微镜在使用 LI 银增强试剂盒（L24919，二级免疫增强剂 - 第 7.2 节）进行银增强后进行检测。

荧光标记和生物素化葡聚糖常用于示踪神经元投射。葡聚糖可以有效地作为顺行或逆行示踪剂， 具体取决于使用的研究方法和组织类型。葡聚糖的活性转运仅发生在活组织中，而不是固定组织中。 对罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明 B 葡聚糖 (D1824) 和赖氨酸化四甲基罗丹明葡聚糖（fluoro-ruby，D1817）的比较研究表明，与相应的游离染料相比，葡聚糖偶联物在注射部位的扩散程度较低，且标记更加持久。 分子量高达 70,000 道尔顿的葡聚糖偶联物已被用于多种物种的神经元示踪研究。不同大小和电荷的荧光葡聚糖偶联物的可用性使得能够分析鱿鱼巨大轴突中的轴突运输的方向和速率。

多重标记葡聚糖

Molecular Probes 可固定葡聚糖，其中大多数是赖氨酸化葡聚糖（参见Molecular Probes葡聚糖偶联物表 - 14.4 中标有单一十字标记（†）的产品），通常更适合用于神经元示踪，因为它们可能具有更有效的运输能力，并可在标记后使用醛固定。我们制备了多种可固定的多重标记葡聚糖，包括一些在各种出版物中获得独特名称的独特性的葡聚糖：

• Fluoro-ruby - 一种红橙色荧光，可通过醛固定10,000 MW 四甲基罗丹明和赖氨酸 (D1817) 标记的葡聚糖，还提供 3000 MW、70,000 MW 和 2,000,000 MW 型号的 fluoro-ruby（D3308、D1818、D7139）。
• Fluoro-emerald—一种绿色荧光，可通过醛固定荧光素和赖氨酸标记的 10,000 MW 葡聚糖 (D1820；，， )。也提供这种标记的葡聚糖，分子量范围为 3000 道尔顿至 2,000,000 道尔顿 (D3306， D1845， D1822 ， D7136 ， D7137 )。
• Micro-ruby (D7162) 和 mini-Ruby (D3312) - 红橙色荧光，可通过醛固定 3000 MW 和 10000 MW 同时标记四甲基罗丹明、生物素和赖氨酸的葡聚糖。
• Micro-emerald (D7156) 和 mini-emerald (D7178) - 绿色荧光，可通过醛固定同时标记荧光素、生物素和赖氨酸的葡聚糖。
• 生物素化葡聚糖胺 (BDA)- 非荧光，可通过醛固定同时标记生物素和赖氨酸的葡聚糖，提供多种分子量（D1956， D1957， D7135， D7142 ）可供选择。已发布一篇关于 BDA 产品的实用综述。

Fluoro-ruby 和 fluoro-emerald () 广泛用于逆行和顺行神经元示踪、 移植 和细胞谱系示踪。 这两种产品都可以用于光转化DAB，生成不溶性、电子密度较高的反应产物。 与 fluoro-ruby 和 fluoro-emerald 一样， micro-ruby和mini-ruby 也具有明亮的荧光，使得在注射过程中可以轻松观察到电极。DiI（D282，膜标记示踪剂 - 第 14.4 节）或在膜标记示踪剂 - 第 14.4 节 中提到的其他亲脂性探针可以用于标记显微下注射的部位。 此外，由于这些葡聚糖包含共价连接的生物素，因此，填充细胞可使用标准酶标记的亲和素或链霉素亲和素偶联物或 NANOGOLD 和 Alexa Fluor FluoroNanogold 链霉素亲和素（亲和素、链霉素亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 生物素结合蛋白和亲和基质—第 7.6 节）进行探测，从而生成实验的永久记录。 mini-Ruby 经证实可用于固定脑切片的细胞内填充 ，并且，有报告称，其染色效果与使用荧光黄 CH（L453、L682、L1177、L12926；极性示踪剂 - 第 14.3 节）得到的染色效果相当。此外，将 mini-ruby 与标准的过氧化物酶介导的亲和素-生物素方法结合使用，不会导致成人大脑中发现的脂褐素颗粒发生共转化，这是荧光黄 CH 光转化过程中常见的问题。 可通过赖氨酸固定的 micro-emerald 和 mini-emerald 葡聚糖（使用荧光素，生物素和赖氨酸三重标记）提供了对比色，能够更好地被共聚焦激光扫描显微镜的氩离子激光激发；它们的用途与 micro-ruby 和 mini-ruby 类似。

3000 MW 葡聚糖

相比于更高分子量葡聚糖，标称 3000 MW 葡聚糖具有多个优势，包括更快的轴突扩散速度和更好的外周细胞过程的进入能力 ()。我们的 "3000 MW" 葡聚糖制剂含有分子量主要在 1500-3000 道尔顿范围内的聚合物，包括染料或其他标记。我们的 3000 MW 葡聚糖选择包括 Alexa Fluor、荧光素、Rhodamine Green、四甲基罗丹明、Texas Red 和生物素偶联物。我们还提供可通过赖氨酸固定的同时标记荧光素 和生物素（micro-emerald，D7156 ）或四甲基罗丹明和生物素（micro-Ruby，D7162）3000 MW 葡聚糖。

已观察到 3000 MW 荧光素葡聚糖和四甲基罗丹明葡聚糖（D3306, D3308; , ）很容易在活细胞中进行顺行和逆行移动。 这些 3000 MW 葡聚糖似乎在神经元过程内被动扩散，因为它们的细胞内运输不会被秋水仙碱或诺考达唑有效抑制，这两者通过解聚微管来破坏主动运输。 此外，这些小葡聚糖扩散速率与磺酰罗丹明 101 和生物胞素等更小的示踪剂 (在 22°C 下为~2 毫米 / 小时) 相当，并且速度约为 10,000 MW 葡聚糖的两倍。葡聚糖的相对低分子量可能导致某些标记探针通过间隙连接进行运输（见下文）。通过使用抗四甲基罗丹明抗体（A6397，抗染料和抗半抗原抗体 - 第 7.4 节）和过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物染色，可以在皮层投射神经元的细小树突结构中检测到四甲基罗丹明偶联葡聚糖的信号。

NeuroTrace BDA -10,000 神经元示踪剂试剂盒

NeuroTrace BDA-10,000 神经元示踪剂试剂盒 (N7167 ) 包含使用 BDA 方法进行神经解剖学示踪所需的各组分，操作方便，包括：

• 可通过赖氨酸固定，生物素化 10,000 MW 葡聚糖胺 (BDA-10,000)
• 辣根过氧化物酶亲和素（HRP 亲和素）
• 3,3'-二氨基联苯胺 (DAB)
• 经过严格测试的快速简便的示踪实验方案（NeuroTrace BDA-10,000 神经元示踪试剂盒）

神经元示踪剂 BDA-10,000 可以在长距离上传输，并双向填充细小的突起，包括顺行方向的突触小体和逆行方向的树突结构。 在将 BDA-10000 注射到目标的大脑区域后的两天到两周，可对脑组织进行固定和切片。BDA-10000 还可用于切割神经，并被允许运输。与 HRP 亲和素孵育后，然后与 DAB 一起孵育，可通过光学或电子显微镜观察电子致密 DAB 反应产物 ()。NeuroTrace BDA-10,000 标记方法可以很容易地与其他顺行或逆行标记方法或者免疫组织化学技术结合使用。BDA-10,000 有单独销售 (D1956)，同时也有其他分子量的 BDA 衍生物可供选择 - BDA-3000 (D7135)、BDA-70,000 (D1957) 和 BDA-500,000 (D7142)。已发表了一项详细的实验方案，该方案使用 Molecular Probes BDA-10,000 探针，HRP 链霉素亲和素（S911、亲和素、链霉素亲和素、中性抗生物素蛋白和 CaptAvidin 生物素结合蛋白和亲和基质 - 第 7.6 节）和四甲基联苯胺对神经元的细小突起进行顺行标记。

荧光葡聚糖—特别是荧光素和罗丹明偶联物—已广泛用于示踪细胞谱系。 我们的 Alexa Fluor 647 和 Alexa Fluor 680 葡聚糖 (D22914， D34680，D34681) 为具有高水平自发荧光或低透明度的标本提供更长波长的检测选项。在这种技术中，葡聚糖被显微下注射到发育中的胚胎的单个细胞中，可以在体内示踪该细胞及其子代的命运 ()。可通过赖氨酸固定的四甲基罗丹明和德克萨斯红葡聚糖偶联物（Molecular Probes 葡聚糖偶联物 - 表 14.4）最常用于谱系示踪研究。作为第二种颜色，尤其是与德州红葡聚糖偶联物结合使用时，研究人员最常使用Molecular Probes 可赖氨酸固定荧光素葡聚糖（例如，D3306、D1820、D1822）。尽管这些可固定的偶联物可以用于长期保存组织，但一些研究人员更倾向于共注射一种荧光的、非赖氨酸化的葡聚糖与一种非荧光的、可赖氨酸固定的生物素葡聚糖（BDA）。然后，非荧光 BDA 可与醛类固定剂固定到位，并可以使用我们在“亲和素、链霉亲和素、 NeutrAvidin 和 CaptAvidin 生物素结合蛋白和亲和基质 - 第 7.6 节”（“Molecular Probes 亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 偶联物 - 表 7.9“）所描述的任何荧光或酶标记的链霉亲和素和亲和素偶联物进行探测。

500,000 和 2,000,000 MW 荧光葡聚糖（Molecular Probes 葡聚糖偶联物 - 表 14.4）偶联物在开发早期阶段的谱系示踪方面可能会特别有用，但这些生物聚合物的水溶性较低，并且比低分子量的葡聚糖偶联物更易发生沉淀或堵塞显微下注射针头。一些研究表明，分子量较低的葡聚糖可能会从胚胎细胞泄漏出来，从而使分析变得复杂。将 2,000,000 MW 荧光素葡聚糖和 2,000,000 MW 德克萨斯红葡聚糖分别注射到两细胞期斑马鱼胚胎的单独细胞中，从而成功构建命运图。 500,000 MW 和 2,000,000 MW 的葡聚糖分别用荧光素、四甲基罗丹明或德克萨斯红染料或生物素标记，所有这些葡聚糖都含有可通过醛固定的赖氨酸基团。非荧光 500,000 MW 氨基葡聚糖 (D7144) 可与研究人员选择的氨基反应性试剂偶联。

葡聚糖的大小可用于研究细胞之间的连接。 例如，关于 3000 MW 葡聚糖通过胞间连丝传代的研究，以及关于转化生长因子-β₁ 和毛喉素对间隙连接通讯的调节作用的研究。 但是，我们的 "3000 MW" 葡聚糖制备品中分子量的分布可能会使这类分析变得复杂，因为这些葡聚糖包含的聚合物的总分子量主要在约 1500–3000 道尔顿之间，但也可能包含 <1500 道尔顿的分子。

一种重要的实验方法，可识别形成间隙连接的细胞，采用了同时引入极性示踪剂荧光黄CH（约 450 道尔顿）和 10,000 MW 的四甲基罗丹明葡聚糖的手段。由于低分子量示踪剂如荧光黄 CH（L453, L12926；极性示踪剂 - 第 14.3 节）能够通过间隙连接，而葡聚糖则不能，因此初始标记的细胞呈现红色荧光，而通过间隙连接相连的细胞则呈现黄色荧光 （见图 14.5.1）。这种技术已被用于示踪腺癌细胞中细胞间通讯的丧失，展示果蝇 伤口愈合过程中通讯的重建，以及研究不同期非洲爪蟾胚胎中的细胞间通讯。 将两种（或更多种）在分子量和染料荧光特性上不同的葡聚糖同时导入细胞，已被用于评估细胞质亚显微结构中的亚细胞异质性。

图 14.5.1 用于识别间隙连接偶联细胞的双示踪技术。A) 用荧光黄 CH（绿色圆圈）等小极性示踪剂的混合物标记的细胞和以较大四甲基罗丹明标记的葡聚糖（红色圆圈）。B) 相邻的间隙连接细胞可被低分子量示踪剂穿透，而较大的葡聚糖偶联物则被排斥在外。采用单色荧光黄 CH 标记的偶联细胞很容易与双重荧光初始标记的细胞区分开来。

标记葡聚糖经常用于研究血管可透过性和血脑屏障的完整性。 分子量为 4000 至 150,000 道尔顿的荧光素葡聚糖已用于确定电穿孔变量（脉冲大小，形状和持续时间）对叶绿体、红细胞 和成纤维细胞中质膜孔径的影响。 光漂白后荧光恢复（FRAP）技术已被用于监测不同分子量的荧光葡聚糖的核质跨膜运输，从而确定核孔膜的尺寸排阻限制，以及研究表皮生长因子和胰岛素对核膜及核质跨膜运输的影响。

显微下注射的 3000 MW 荧光葡聚糖在果蝇胚胎的间期细胞核中浓集，而 40,000 MW 葡聚糖则停留在细胞质中，只有在前期核膜破裂后才进入细胞核。这一尺寸排除现象被用于示踪细胞分裂过程中核膜的周期性破裂和重建。 同样，我们的 10,000 MW 钙绿葡聚糖偶联物（C3713，荧光钙离子指示剂偶联物 - 第 19.4 节）经证明能够穿透从非洲爪蟾卵母细胞中分离出来的核膜，而 70,000 MW 和 500,000 MW 的偶联物则无法穿透。 值得注意的是，通过肌醇 1,4,5-三磷酸（Ins 1,4,5-P₃，I3716；钙调节 - 第 17.2 节）或钙螯合剂（螯合剂、标定缓冲液、离子载体和细胞导入试剂 - 第 19.8 节）耗竭核内钙离子 (Ca²⁺) 储存，能够阻断 10,000 MW 钙绿葡聚糖偶联物的核内摄取，但不会影响荧光黄 CH 的进入。我们的 3000 MW 钙绿葡聚糖偶联物 (C6765) 在成体神经纤维中主动运输，能够在较长距离内传输，并以允许监测突触前 Ca ²⁺水平的形式保留在突触前末端。

荧光葡聚糖

示踪外源性导入的荧光标记葡聚糖的内化是分析液相内吞作用的标准方法 我们提供标称分子量为 3000 至 2,000,000 道尔顿的葡聚糖，其中许多还可用作胞饮或吞噬作用标记物（Molecular Probes 葡聚糖偶联物 - 表 14.4)。通过使用能够淬灭外部探针荧光的试剂，可以有效区分内吞的荧光葡聚糖与生长培养基中的葡聚糖。例如，我们的大多数抗荧光基团抗体（抗染料和抗表位抗体 - 第 7.4 节，抗荧光团和抗表位抗体 - 表 7.8）能强烈地淬灭与之对应的染料的荧光。

通过补丁微电极将荧光葡聚糖内注射到活胰腺腺泡细胞中所产生的阴性染色表明存在非内吞性液泡；然后，外部添加第二种颜色对比的葡聚糖可以区分内吞性和非内吞性液泡。 现已描述一种用于早期内体同质融合的体外检测方法，其中，两种细胞群体通过流体相摄取分别用 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 10,000 MW 葡聚糖（D22910，D22914）进行标记，随后通过亚细胞分级和内体荧光共定位分析进行检测。 内体的细胞内融合也通过使用 BODIPY FL 亲和素偶联物进行监测，方法是跟踪其与生物素化葡聚糖复合时发生的荧光增强现象。

pH 指示剂葡聚糖

我们用于制备 Molecular Probes 葡聚糖偶联物的一些染料显示，其荧光对培养基 pH 值敏感； pH 值指示剂葡聚糖及其光学反应详见 pH 值指示剂偶联物 - 第 20.4 节。因此，通过测量染料荧光的变化，通常可以示踪标记的葡聚糖进入细胞酸性细胞器的过程。荧光素葡聚糖 (p_Ka 为 ~6.4) 常用于研究内吞酸化的过程。 荧光素标记的葡聚糖在酸化后被强烈淬灭；但是，荧光素在酸性溶液中缺乏光谱偏移，这使得很难区分荧光被淬灭的已内化探针和外部介质中的残留荧光。在酸性环境中能够发生发射光谱偏移的葡聚糖偶联物，如 SNARF 葡聚糖（pH 指示剂偶联物 - 第 20.4 节），或者在激发光谱上发生显著偏移的葡聚糖偶联物，如 BCECF 和 Oregon Green 葡聚糖（pH 指示剂偶联物 - 第 20.4 节），为荧光素提供了替代选择。Oregon Green 488 和 Oregon Green 514 葡聚糖的 pK_a 约为 4.7，有利于在酸性环境中进行测量。 除了这些 pH 值指示剂葡聚糖，我们还制备了一种用荧光素和四甲基罗丹明 (D1951； pH 值指示剂偶联物 - 第 20.4 节) 双标记的葡聚糖，该葡聚糖已用作比率指示剂 (图 14.5.2) ，用于测量 Hep G2 细胞 和小鼠肺泡巨噬细胞中的核内体酸化。

与荧光素和 Oregon Green 488 葡聚糖相比，pHrodo 10,000 MW 葡聚糖 (P10361) 在酸化反应中显示出增加的荧光 (图 14.5.3)。pHrodo 葡聚糖在中性 pH 条件下发出的极小荧光信号可防止检测非内化和非特异性结合偶联物，无需淬灭试剂和额外的洗涤步骤，从而提供一种简单的内吞活性荧光检测方法。 pHrodo 葡聚糖的最大激发波长和发射波长分别为 560 和 585 nm ，可促进与其他荧光基团（包括蓝色，绿色和远红外荧光探针）的多重分析。尽管 pHrodo 葡聚糖在约 560 nm 波长下的激发效果最佳，但它也可以通过流式细胞仪、共聚焦显微镜和成像微孔板读数仪中氩离子激光的 488 nm 谱线轻松激发（图 14.5.4）。

图 14.5.2 双标记荧光素 - 四甲基罗丹明葡聚糖 (D1951) 的激发光谱，其含有 pH 依赖性 （荧光素）和 pH 非依赖性（四甲基罗丹明）染料。

图 14.5.3荧光微孔板读数仪中在 545/590 nm 处监测的 pHrodo 葡聚糖 (P10361) 的 pH 值响应曲线。使用柠檬酸盐、MOPS 和硼酸盐缓冲液覆盖 2.5 至 10 的 pH 值范围。

图 14.5.4 使用 pHrodo 葡聚糖偶联物示踪内吞作用抑制。将 HeLa 细胞接种至 96 孔板中，并在 pHrodo 胞吞作用检测前，在 37°C 下使用染料处理 3 小时。接下来，将 40 µg/mL 的 pHrodo 10,000 MW 葡聚糖（P10361）在 37°C下孵育 30 分钟，然后用 HCS NuclearMask Blue 染料（H10325）染色 10 分钟，以显示总细胞数并提供分界标记，用于图像分析。图像在 BD 途径 855 高内涵生物成像仪 (BD Biosciences) 上采集。

荧光葡聚糖是研究细胞质基质流体动力学特性的重要工具。这些荧光示踪剂的细胞内流动性可以通过荧光恢复后光漂白（FRAP）技术进行研究。我们提供一系列大小的葡聚糖，因此提供了各种流体动力学辐射，用于研究细胞质基质的性质和周围膜的渗透性。由于荧光葡聚糖的溶解度和生物相容性，已用于监测眼前房-巩膜道、毛细管 和近端小管中的体内组织渗透性和流动以及大脑细胞外环境中高分子量物质的扩散。